Fatores de transcrição reguladores do metabolismo do glicogênio em Neurospora crassa: caracterização parcial e identificação de alvos de ligação por ChIP-Seq

Abstract

Resultados prévios, em nosso laboratório, permitiram identificar fatores de transcrição provavelmente atuando como reguladores do metabolismo de glicogênio no fungo Neurospora crassa utilizando uma coleção de linhagens mutantes do fungo contendo ORFS codificadoras de fatores de transcrição individualmente nocauteadas. O presente trabalho teve como objetivo realizar análises funcionais de alguns dos fatores de transcrição anteriormente identificados, tais como o regulador transcricional XlnR, descrito em outros fungos filamentosos como regulador de genes codificadores de enzimas xilanolíticas e/ou celulolíticas e o produto da ORF NCU04390, uma proteína sem função conhecida. Inicialmente foram realizadas análises de acúmulo de glicogênio e da expressão dos genes gsn (codificador da enzima glicogênio sintase) e gpn (codificador da enzima glicogênio fosforilase) durante o crescimento vegetativo (30ºC) e sob condição de estresse térmico (45ºC) nas linhagens mutantes e comparadas à linhagem selvagem. Ambas as linhagens mutantes apresentaram alterações tanto no conteúdo de glicogênio como na expressão dos genes citados anteriormente, o que indicou o possível envolvimento dos fatores de transcrição na regulação do metabolismo do carboidrato. Foram realizados experimentos com o objetivo de investigar a função do fator de transcrição XlnR na regulação do metabolismo de glicogênio. Foi verificado que esta proteína regula os níveis do carboidrato, bem como a expressão do gene gsn quando o fungo foi crescido em fontes alternativas de carbono. Entretanto, o fator de transcrição XLR-1 de N. crassa produzido na forma recombinante em E. coli (inteiro e truncado) não foi capaz de ligar ao motif presente no promotor gsn. Genes codificadores de duas endoxilanases foram identificados no genoma de N. crassa...

Previous results from our laboratory using a collection of Neurospora crassa strains mutated in genes encoding transcription factors allowed us to identify transcription factors likely involved in glycogen metabolism regulation. The present work aimed to perform a functional analysis of some transcription factors previously identified, such as the transcriptional regulator XlnR, described in many filamentous fungi as a transcriptional regulator of xylanolitic and/or cellulolitic genes and a protein with unknown function, the ORF NCU04390 product. Initially, analysis of glycogen accumulation and gsn (coding glycogen synthase) and gpn (coding glycogen phosphorylase) gene expression were performed under vegetative growth (30 °C) and under heat shock cond ition (45 ºC) in the two mutant strains and compared to the wild-type strain. Both mutant strains showed changes in the glycogen levels as well as in the gsn and gpn expression, suggesting an involvement of these transcription factors in the regulation of glycogen metabolism. Additional analysis was performed in order to investigate the function of the XlnR transcription factor. It was observed that this transcription factor regulates the glycogen levels as well as the gsn expression under alternative carbon sources. However, the recombinant XLR-1 transcription factor produced in E. coli (entire and truncated proteins) was not able to bind to the XLR-1 motif present in the gsn promoter. Two endoxylanases coding genes were identified in the N. crassa genome database and analysis of their gene expression showed the upregulation of both genes during growth in xylan instead of xylose as carbon sources. This result suggested that the XLR-1 transcription factor is not the only protein that regulates the endoxylanases genes. The transcription factor encoded by NCU04390 ORF was... (Complete abstract click electronic access below)