Contribuição para a clonagem em eqüinos por meio de tranferência nuclear

Abstract

Nos eqüideos o primeiro relato de sucesso na clonagem foi em Idaho – EUA, em maio de 2003 com o nascimento de uma mula clonada a partir de células fetais, e desde então esta biotecnologia contabiliza somente 21 eqüideos clonados no mundo. A clonagem em eqüídeos é extremamente difícil, pois os ovócitos não maturam bem in vitro, o que diminui significativamente a disponibilidade de citoplastos receptores de qualidade. Além disso, a dificuldades na obtenção de material em matadouros comerciais, o alto custo de manutenção dos animais em fazendas, bem como as baixas taxas de produção de blastocistos por transferência nuclear (3 a 10%) fazem com que poucos laboratórios se dediquem aos estudos dos processos envolvidos na produção in vitro de embriões de eqüídeos. Sendo assim, este projeto teve como objetivo geral criar no Laboratório de Produção in vitro da FMVZ – UNESP - Botucatu, condições para a produção no Brasil de eqüídeos clonados. No experimento I não foram observadas diferenças significativas (p = 0,661) entre a privação de soro fetal bovino e a confluência na integridade de membrana de fibroblastos eqüinos em cultivo pós-descongelação (>87%). Sob as mesmas condições de cultivo, foram avaliadas as taxas de sincronização do ciclo celular de fibroblastos eqüinos em G0/G1 na tentativa de estabelecer um protocolo de utilização destas células como doadoras de núcleo. As mais altas taxas de células sincronizadas em G0/G1 (> 97%) foram obtidas às 72, 96 e 168 horas após o início da privação de soro fetal bovino a 0,5%. No experimento II a incubação de ovócitos eqüinos em 66g/ml de roscovitine por 24 horas, pré e pós-maturação in vitro, foi eficiente na inibição da meiose, sincronizando o início do processo, permitindo uma melhor programação...

In the equine species, the first reported success of a cloned animal took place in Idaho, USA, in May 2003 when a cloned mule was born. In order to produce this clone fetal cells were used. Since then only 21 cloned horses births were reported. Equine cloning is extremely complicated due to difficulties in oocyte in vitro maturation, wich significantly reduce the availability of good quality oocytes to receive the genetic material of the donor cell. Moreover, the low number of commercial slaughterhouses, the high cost of maintenance of animals in the farms and the low efficiency of the method (3 to 10% blastocyst development) leads to the fact that only a few laboratories around the word are dedicated to study the process involved in horse embryos in vitro production. The main objective of the present experiment was to create, at the In Vitro Fertilization Laboratory from FMVZ – UNESP - Brazil, conditions to produce a equine clone. With this aim, five experiments were performed. In Experiment I no statistic differences (p = 0.661) were observed with the utilization of serum starvation or culture until confluence on viability of equine fibroblasts cultured after thawing (>87%). With the attempt of establishing a protocol to use these cells as nuclear donors, the cell cycle of equine fibroblasts were studied under the same conditions. The higher rates of cell cycle synchronization in G0/G1 (> 97%) were obtained 72, 96 and 168 hours after the beginning of serum starvation (0.5% fetal calf serum). In the Experiment II, the incubation of equine oocytes with 66g/ml of roscovitine during 24 hours, pre- and post- in vitro maturation, was efficient in inhibit meiosis, allowing a better organization of the nuclear transfer procedure. The meiosis blockage showed to be fully reversible after the removal of the roscovitine when nuclear maturation rates were compared with non-exposed oocytes (p = 0,714 for expanded COC and p = 0,275 for compact COC).