Adição de ácido linolênico e L-carnitina na maturação oocitária: efeitos sobre o metabolismo celular, potencial de desenvolvimento e criotolerância de embriões bovinos produzidos in vitro

Abstract

Com o intuito de aperfeiçoar os resultados da criopreservação de embriões bovinos produzidos in vitro (PIV), este estudo foi conduzido com o objetivo principal de avaliar o impacto da suplementação do meio de maturação in vitro (MIV) com ácido linolênico (ALA), associado ou não à L-carnitina (L-car), sobre a maturação e qualidade do oócito, especialmente no que se refere ao metabolismo lipídico, e sobre o desenvolvimento e resistência à criopreservação dos embriões produzidos. Para tanto, em uma primeira etapa (Experimentos I e II) foram realizados experimentos de dose-resposta para determinar as concentrações ideais de ALA (0, 10, 50 ou 100 µM) e L-car (0, 1, 5 ou 10 mM) a serem adicionadas ao meio de MIV, suplementado com 10% de soro fetal bovino (SFB) ou 0,6% de albumina sérica bovina (BSA). Foram avaliados os efeitos do ALA e L-car sobre a maturação nuclear e citoplasmática (avaliação mitocondrial, acúmulo lipídico intracelular e produção de espécies reativas de oxigênio intracelulares (ROS) em oócitos bovinos) e o subsequente desenvolvimento embrionário. No Experimento I, a adição de 100 µM de ALA em meio de MIV suplementado com SFB resultou em redução (P<0,05) do acúmulo lipídico citoplasmático e do acúmulo intracelular de ROS, assim como aumento (P<0,05) do potencial de membrana mitocondrial (PMM), em relação às demais concentrações de ALA. No entanto, nenhum desses efeitos prejudicou (P>0,05) a maturação oocitária e o subsequente potencial de desenvolvimento embrionário. No Experimento II, a suplementação do meio de MIV com L-car resultou em redução (P<0,05) do acúmulo lipídico citoplasmático, na presença de SFB. Somados os efeitos da concentração de 10 mM de L-car na presença de SFB sobre a redução (P<0,05) do PMM e elevação (P<0,05) do conteúdo de ROS e, do efeito negativo (P<0,05) da suplementação do meio de MIV com BSA sobre o desenvolvimento embrionário, conclui-se que a suplementação com 5 mM de L-car na presença de SFB superou os resultados dos demais grupos. Em uma segunda etapa (Experimento III), baseado nos resultados dos experimentos anteriores foi avaliado o efeito da suplementação com ALA (100 µM), L-car (5mM) ou a associação de ambos os tratamentos (ALA + L-car), durante o cultivo de MIV com 10% de SFB, sobre o subsequente desenvolvimento in vitro, qualidade embrionária (avaliada pela contagem do número total de células e taxa de apoptose), conteúdo intracelular de ROS e acúmulo lipídico intracitoplasmático, além da criotolerância embrionária. Para tanto, oócitos foram fecundados durante 24 horas e os prováveis zigotos cultivados in vitro (CIV). Foram avaliadas a taxa de clivagem (48 hpi) e o desenvolvimento embrionário até a fase de blastocistos (D7 do CIV). Estes foram vitrificados e posteriormente reaquecidos para avaliação da sobrevivência embrionária pós-criopreservação, após 24 h e, taxa de eclosão após 48 h de re-cultivo in vitro. Também nesta etapa, foi avaliada a regulação da expressão de genes envolvidos com o metabolismo lipídico (regulação da lipogênese: SCD1, FASN e SREBP1; regulação da via metabólica de β-oxidação: CPT1B e CPT2), em oócitos suplementados com ALA e/ou L-carnitina durante o cultivo de MIV, e nos embriões produzidos. Os tratamentos com ALA e L-car realizados na etapa de MIV não suportaram os efeitos positivos observados nos estudos anteriores sobre a redução do acúmulo lipídico e melhora do potencial de desenvolvimento oocitário. Os tratamentos não alteraram o conteúdo lipídico e consequentemente a criotolerância dos embriões resultantes. Apesar disso, houve melhora da qualidade embrionária pela redução do índice apoptótico e acúmulo de ROS. A expressão dos genes relacionados à lipogênese sofreram influência do tratamento com os suplementos realizado na MIV. Porém, para os genes relacionados à lipólise, um possível efeito positivo foi perdido e, talvez seja necessário o tratamento na etapa de CIV. Portanto, mais estudos são necessários para avaliar a etapa mais adequada da PIV para se realizar a suplementação com ALA, L-car e a associação de ambos os tratamentos, objetivando alterar o conteúdo lipídico e consequentemente a criotolerância embrionária.

In order to improve the results of cryopreservation of bovine in vitro produced (IVP) embryos, this study was conducted with the main objective to assess the impact of in vitro maturation medium (IVM) supplementation with linolenic acid (ALA), associated or not with L-carnitine (L-car), on oocyte maturation and quality, specially regarding to lipid metabolism and on development and cryoresistance of produced embryos. Therefore, in a first step (Experiments I and II) were performed dose-response experiments to determine the optimal concentrations of ALA (0, 10, 50 or 100 μM) and L-car (0, 1, 5 or 10 mM) to be added to IVM medium, supplemented with 10% fetal calf serum (FCS) or 0.6% bovine sérum albumin (BSA). The effects of ALA and L-car on nuclear and cytoplasmic maturation [mitochondrial evaluation, intracellular lipid accumulation and intracellular production of reactive oxygen species (ROS)] and subsequent embryonic development were evaluated. In Experiment I, the IVM supplementation with 100 mM of ALA in FCS-supplemented medium resulted in reduction (P<0.05) of cytoplasmic lipid and intracellular ROS accumulation, as well as, increased (P<0.05) mitochondrial membrane potential (MMP), relative to the other ALA concentrations. However, none of these effects damaged (P<0.05) oocyte maturation and the subsequent embryo development potential. In Experiment II, the IVM medium supplementation with L-car resulted in significant reduction (P<0.05) of cytoplasmic lipid content even in the FCS presence. Combined effects of 10 mM L-car in FCS-supplemented medium on MMP reduction (P<0.05), ROS production increase (P<0.05), and the negative effect (P<0.05) on embryonic development of BSA IVM medium supplementation, we can conclude that concentration of 5 mM L-car in the presence of FCS exceeded the results of the other groups. Based on previous experiments results, in a second step (Experiment III), the effects of supplementation with ALA (100 μM), L-car (5 mM) or a combination of both treatments (ALA + L-car) during IVM culture, with 10% FCS were evaluated on subsequent embryo development and quality (assessed by total cell number and apoptosis rate), intracellular lipid and ROS content, in addition to embryonic cryotolerance. For this, oocytes were fertilized for 24 h and the presumptive zygotes in vitro cultured (IVC). Cleavage rate (48 hpi) and embryonic development until blastocyst stage (D7 IVC) were evaluated. Blastocysts were vitrified and subsequently warmed for post-cryopreservation embryo survival evaluation, after 24 h, and hatching rate, after 48 h IVC. The gene expression regulation of lipid metabolism related genes (lipogenesis regulation: SCD1, FASN and SREBP1; β-oxidation pathway regulation: CPT1B and CPT2), was also performed in this step. There were evaluated ALA and/or L-car supplemented oocytes during IVM culture, and the produced embryos. The treatments made in IVM step did not support the positive effects observed in the previous studies on the lipid content reduction and the improvement in oocyte development potential. They did not change the lipid content and therefore, embryonic cryotolerance. Despite this, there was an improvement in embryo quality by reduction of the apoptotic index and ROS production. Lipogenesis-related genes expression was influenced by the treatment conducted during IVM. However, for lipolysis-related genes, a potential positive effect was losted and, may be need the treatment on IVC step. Therefore, further studies are necessary to assess the most appropriate IVP step to perform ALA, L-car and the combination of both treatments supplementation, aiming changes in lipid content, and consequently the embryonic cryotolerance.