Avaliação da atividade citotóxica e tipo de morte em linhagens celulares humanas tratadas com derivados vegetais e metabólitos secundários de Baccharis trimera (Less.) DC.

Abstract

Produtos derivados de fontes vegetais tem demonstrado seu potencial no combate a diversas doenças, inclusive o câncer, à exemplo dos alcaloides derivados de Catharantus roseus (L.)G. Don, vincristina e vimblastina. A diversidade estrutural das moléculas encontradas em espécies vegetais concebem perspectivas de uso in natura bem como servem de inspiração para o desenvolvimento de outras entidades químicas que serão destinadas ao combate de doenças. O material de estudo pertence a espécie Baccharis trimera (Less.) DC, popularmente conhecida como carqueja e com amplo uso tradicional, principalmente para o alívio de afecções digestivas. O estudo teve por objetivo o fracionamento cromatográfico de derivados vegetais de partes aéreas de B. trimera e a avaliação da citotoxicidade e estudo de morte em linhagens de células humanas normal e tumorais tratadas com o OE, suas frações e componentes, além da flavona eupatorina isolada do extrato acetato de etila. O potencial citotóxico foi avaliado através do método da sulforrodamina B e os estudos de morte através de ensaios de Anexina-V, Hoechst/iodeto de propídeo e ativação de caspase-3. As linhagens celulares humanas utilizadas foram de câncer de mama (MCF-7), hepatocarcinoma (HepG2) e a linhagem de mama normal (MCF-10). As amostras avaliadas foram o óleo essencial, suas frações e componentes (α-humuleno, trans-cariofileno e óxido de cariofileno), além da eupatorina. Os constituintes majoritários do óleo essencial identificados por CG-EM foram: trans-cariofileno(18,9 %), biciclogermacreno (15,6 %), germacreno D (10,5 %) e δ-cadineno (6,6 %); α-humuleno (2,3 %) e óxido de cariofileno (2,9 %) também foram identificados. As frações do óleo essencial foram obtidas por cromatografia em coluna (sílica gel) e analisadas por CG-DIC e CG-EM, tendo apresentado composições químicas distintas. A flavona eupatorina (pureza em 250 nm de 96 % m/m) foi isolada a partir do extrato acetato de etila utilizando cromatografia em camada delgada preparativa (sílica gel) e identificada por técnicas espectrométricas (EM, UV, RMN de 1H e 13C). Verificou-se o maior potencial de redução de sobrevida com o OE em HepG2 (CI50= 10,40 μg/mL), α-humuleno e trans-cariofileno em MCF7 (CI50 de 7,59 e 11,52 μg/mL, respectivamente) enquanto que a eupatorina mostrou-se mais citotóxica em MCF10A com valor de CI50 pouco distante do encontrado para MCF7 (5,08 e 6,73 μg/mL, respectivamente). Grande parte das frações do OE foi citotóxica às linhagens e foram necessárias concentrações mais altas para atingir o CI50. As amostras apresentaram morte mista em todas as linhagens ocorrendo tanto apoptose quanto necrose. Não houve significância estatística no ensaio de ativação da via de apoptose por caspase-3. Constatou-se a eficiência das técnicas cromatográficas no tocante à identificação e separação de constituintes químicos, das técnicas espectrométricas para a identificação e determinação estrutural da substância eupatorina, bem como o potencial de morte celular, e até mesmo antitumoral, de amostras analisadas neste trabalho.

Natural products diversity is an important source to find potential treatments against various diseases, including cancer. Vincristine and vimblastine, alkaloids derived from Catharantus roseus (L.) L. Don, are some of the examples. The structural diversity of molecules from plant species allow the in natura usage and also the development of other chemical entities that will be used to diseases control. Baccharis trimera (Less.) DC., popularly known as carqueja, has an extensive traditional use, especially for digestive disorders. The aims of this study were the chromatographic fractionation of aerial parts from carqueja, in vitro evaluation of the cytotoxic potential through sulforhodamine B assay and cellular death by Annexin-V assay, Hoechst/propidium iodide method and caspase-3 activation, in normal and tumor cell lines treated with essential oil, its fractions and components, and the flavone eupatorin isolated from ethyl acetate extract. The cell lines used were human breast cancer (MCF-7), hepatocellular carcinoma (HepG2) and normal breast line (MCF-10a). The evaluated samples were: essential oil, its fractions and components (α-humulene, β- caryophyllene and caryophyllene oxide) and eupatorin. The major constituents of the essential oil identified by GC-MS were: β-caryophyllene (18.9%), bicyclogermacrene (15.6%), germacrene D (10.5%), δ-cadinene (6.6%). Other components of the essential oil, such as α-humulene (2.3%) and caryophyllene oxide (2.9%) were also identified. The essential oil fractions were obtained by column chromatography (silica gel) and analyzed by GC-FID and GC-MS, presenting different chemical compositions. The flavone eupatorin (96% purity in 250 nm; w/w) was isolated from ethyl acetate extract using preparative thin layer chromatography (silica gel) and identified by spectrometric methods (MS, UV, 1H and 13C NMR). The largest decrease in cell viability for HepG2 was observed with essential oil (IC50 = 10.40 μg / mL); α-humulene and trans-caryophyllene for MCF7 cells (IC50 7.59 and 11.52 μg / mL, respectively) and eupatorin for MCF10A (IC50= 5.08 μg / mL). IC50 for eupatorin in MCF7 cells was 6.73 μg / mL. Most of the essential oils fractions were cytotoxic to the cell lines and higher concentrations were required to achieve IC50. There was not a cell death standard since apoptosis and necrosis occurred as well. Statistical significance was not found in caspase-3 assay. Chromatographic techniques were efficient for compounds identification and separation, and spectrometry techniques for structural determination of eupatorin. The results from this research shown therapeutic potential against cancer for the studied samples.