Desenvolvimento de protótipos antifúngicos contra Cryptococcus gattii utilizando modelos alternativos animais

Abstract

A criptococose é uma infecção fúngica sistêmica e oportunista, causada pelas leveduras capsuladas das espécies Cryptococcus neoformans e Cryptococcus gattii, afetando tanto pacientes imunocompetentes quanto imunocomprometidos. Uma propriedade importante do gênero Cryptococcus é a capacidade de formação de biofilmes. A resistência dos biofilmes aos agentes antifúngicos traz a necessidade da busca de novas terapias. Desta forma, o nosso grupo vem trabalhando com moléculas antifúngicas derivadas de fontes naturais, como as chalconas, onde foi verificado que C. neoformans é sensível a algumas destas moléculas. Assim, o objetivo desse trabalho foi testar a 3’- chalcona como antifúngico contra C. gattii em situação planctônica e biofilme, como também a eficiência e toxicidade em modelos animais alternativos como Danio rerio (Zebrafish) e Galleria mellonella, propondo uma nova alternativa para o tratamento. In vitro, os resultados para a forma planctônica do fungo mostraram que a 3’- chalcona foi mais eficaz para a cepa 118, com concentração inibitória mínima (CIM) de 0,96 µg/mL e para a cepa 56990 de C. gattii, a molécula mostrou ação potente com CIM entre 1,95 e 3,90 µg/mL. No ensaio de formação do biofilme com as duas cepas, observou-se uma atividade metabólica crescente até 72 horas e uma biomassa e matriz extracelular que alcançou seu máximo nas 48 horas. Em seguida, foi feita a avaliação da atividade da 3’- chalcona contra a formação do biofilme maduro após 48 horas, apresentando uma inibição a uma concentração de 62,5 µg/mL para cepa ATCC e de 31,2 µg/mL frente ao isolado 118. Também foi avaliado o crescimento do biofilme frente à anfotericina B (AmB), obtendo como resultado, inibição em todas as concentrações por parte das duas cepas e, frente ao fluconazol, apresentaram-se resistentes. In vivo, os resultados de toxicidade em embriões de Zebrafish revelaram uma concentração letal 50% (CL50) de 3,42±0,6 µg/mL em 48 horas pós-fertilização (hpf). No modelo G. mellonella as doses testadas de 3’- chalcona (2 a 160 mg/Kg) não foram tóxicas. Entretanto, nas larvas infectadas com as duas cepas de C. gattii, a molécula não apresentou eficácia antifúngica. Assim, considerando o potencial antifúngico in vitro, inclusive contra o biofilme de C. gattii, a 3’- chalcona pode passar por modificações moleculares que aumentem sua distribuição e eficácia in vivo.

Criptococose is a fungal, systemic and opportunistic infection mainly caused by capsulated yeast of the species Cryptococcus neoformans e Cryptococcus gattii, affecting immunocompetent and immunocompromised patients. An important property of the genus Cryptococcus is the biofilm formation, which can be considered a virulence factor and resistance. The resistance of biofilms to antifungal agents brings the need to search new therapies. Thus, our group has been working with antifungal molecules derived from natural sources such as chalcones, where it was found that C. neoformans is sensitive to some of these molecules. For this fact, the objective of this study was to test the 3'- chalcone as antifungal against C. gattii in planktonic and biofilm forms, as well as efficiency and toxicity in alternative animal models like Danio rerio (Zebrafish) and Galleria mellonella, proposing a new alternative for treatment. In vitro, the results for the planktonic form of the fungus showed that the 3'- chalcone was more effective for the 118 strain, the minimum inhibitory concentration (MIC) was 0.96 µg/mL. For the strain 56990 of C. gattii the molecule showed potent activity with MIC values between 1.95 and 3.90 µg/mL. Biofilm formation assay for both strains had an increased metabolic activity within 72 hours and a biomass and extracellular matrix which reached its maximum in 48 hours. Then, the evaluation of the activity of the 3'-chalcone against the formation of mature biofilm was made after 48 hours, showing inhibition at a concentration of 62.5 µg/mL for ATCC strain and 31.2 µg/mL against the isolated 118. Also, the growth of biofilm against to amphotericin B (AmB) was evaluated, obtained as a result of inhibition at all concentrations for the two strains and against fluconazole were resistant. In vivo, the results of toxicity in zebrafish embryos revealed a lethal concentration 50% (LC50) of 3.42 ± 0.6 µg/mL at 48 hours post-fertilization (hpf). In the model G. mellonella tested doses of 3’- chalcona (2 to 160 mg/kg) were not toxic. However, in larvae infected with the two strains of C. gattii, the molecule did not show efficacy of antifungal agents. Thus, considering the potential antifungal in vitro, including against biofilms of C. gattii, 3'- chalcone can experiment molecular changes that increase their distribution and efficacy in vivo.