Condensação-psi do DNA: um estudo teórico e experimental

Abstract

Na presente tese, a condensação-psi (“psi é a abreviação para a sentença em língua inglêsa “polymer and salt induced” - condensação induzida por polímero e sal”) do DNA é estudada experimentalmente e teoreticamente em diferentes contextos. Experimentos utilizando espectroscopia de dicroísmo circular são realizados para elucidar a influência do peso molecular do polímero flexível na condensação e decondensação reentrante do DNA. O diagrama de fase completo da transição é determinado e comparado com predições teóricas existentes. Um acordo quantitativo completo é encontrado com relação à condensação, mas apenas um acordo qualitativo é obtido com relação à transição reversa devido às aproximações da teoria. Esse problema teórico é revisitado nesta tese e um modelo teórico menos restritivo é desenvolvido ao longo das linhas originais da teoria das interações de depleção propostas por Asakura e Oosawa. A decondensação reentrante é encontrada em um amplo espectro de concentrações do sal e a dependência da concentração crítica do polímero flexível (PEGcrit) com relação ao seu peso molecular para ambas as transições está em acordo qualitativo com os dados experimentais. É também discutido ao longo desta tese, o sinergismo experimentalmente observado entre as interações de depleção e a complexão de proteínas básicas com o DNA na condensação dessa macromolécula. Experimentos de eletroforese em gel de agarose e espalhamento dinâmico de luz são realizados para esclarecer esse sinergismo e propôr um modelo microscópico para a formação e estabilidade do nucleóide em células procarióticas. Por fim, é investigada experimentalmente e teoreticamente a influência da topologia do DNA na condensação-psi. Os valores do PEGcrit são experimentalmente determinadas para a forma superhelicoidal e a forma linear...

In the present thesis, the DNA psi-condensation is studied both experimental and theoretically in several different contexts. Experiments using circular dichroism spectroscopy were performed in order to elucidate the influence of the flexible polymer's molecular weight on the DNA condensation and reentrant decondensation. The whole phase diagram was determined and compared with theoretical predictions. A full quantitative agreement is found for the condensation transitions; as far the reentrant decondensation transition is concerned, the model does not predict the entire phase diagram due to its assumptions. This theoretical problem is revisited in this thesis and a less restrictive model is developed along the lines of the original Asakura-Oosawa model for depletion interactions. The DNA reentrant decondensation is found within a wide range of salt concentration and the critical PEG (poly ethyleneglicol) concentrations (PEGcrit) dependence on the PEG’s degree of polymerization is in qualitative agreement with the experimental data. We also discuss in this thesis, the synergism found between molecular crowding and the “histone-like” protein binding to DNA molecules in condensing DNA. An agarose gel electrophoresis assay and dynamic light scattering experiments were performed in order to elucidate this synergism and to propose a microscopic model for the formation and stability of the prokaryotic nucleoid. At last, we investigate both theoretical and experimentally the influence of the DNA topology on the DNA psi-condensation, namely we investigate the role of super-coiling on the polymer induced DNA condensation and compare the PEGcrit critical concentrations for the super-coiled DNA as well as for the linearized form. Both experiments and analytical estimatives show that supercoiling has a limited role on the phase separation which accounts for the DNA condensation... (Complete abstract click electronic access below)