Citotoxicidade, produção de espécies reativas de oxigênio, expressão de marcadores celulares e produção de TNFα em macrófagos após exposição a agentes clareadores

Abstract

O objetivo deste estudo foi avaliar a citotoxicidade, produção de espécies reativas de oxigênio, análise de marcadores celulares e presença de TNFα em macrófagos após exposição a agentes clareadores. Foram utilizadas culturas celulares de macrófagos RAW 264.7 expostas a dois géis clareadores: Peróxido de hidrogênio 40% e Peróxido de Carbamida 20% e ao Peróxido de Hidrogênio puro (10%) que atuou como controle positivo, em diversos períodos de avaliação. Esses clareadores foram utilizados sozinhos e aditivados à NAC e ao BSO. A viabilidade celular foi determinada pelo ensaio MTT, assim como a sobrevivência celular foi avaliada pelo ensaio cristal violeta. A liberação de espécies reativas de oxigênio foi mensurada utilizando uma sonda fluorescente sensível a oxidação-H2DCF-D. Para a verificação da presença dos marcadores celulares CD14, CD40 e CD54, envolvidos no processo inflamatório e na resposta imune, foi utilizada a citometria de fluxo, enquanto que a produção de TNFα foi quantificada por ELISA. A análise estatística foi realizada através do teste Mann–Whitney com nivel de significancia a 5%. Os resultados obtidos permitiram concluir que: todos os peróxidos diminuiram a viabilidade e a sobrevivência celular, sendo a toxicidade desses clareadores porporcional às suas concentrações; todos os peróxidos estimularam a produção de ROS, sendo que a NAC apresentou tendência a diminuir essa produção, enquanto que o BSO apresentou efeito oposto; a expressão dos marcadores celulares foram aumentadas pelo uso do LPS, sendo o marcador mais expresso o CD54, seguido pelo CD40 e CD14; a estimulação por LPS aumentou a produção de TNFα e os peróxidos tiveram a tendência a aumentar essa produção

The aim of this study was to evaluate the cytotoxicity, production of reactive oxygen species, analysis of cellular markers and the presence of TNFa in macrophages after exposure to bleaching agents. Cultures of RAW 264.7 macrophages were exposed to two bleaching gels: 40% Hydrogen Peroxide 20% Carbamide Peroxide; 10% pure Hydrogen Peroxide served as positive control, in different periods. These bleaching agents were used alone and associated with NAC and BSO. Cell viability was determined by MTT assay, and cell survival was assessed by crystal violet assay. The release of reactive oxygen species was measured using a fluorescent probe sensitive to oxidation-H2DCF-D. To verify the presence of the surface markers CD14, CD40, and CD54, involved in the inflammatory and immune response, it was used a flow cytometry, while the production of TNFa was measured by ELISA. Statistical analysis was performed using the Mann-Whitney test with a significance level of 5%. Results conclued that: all peroxides decreased the viability and cell survival, and toxicity of these bleaching was in proportion to their concentrations; all peroxides stimulated ROS production, and NAC showed a tendency to reduce this production while the BSO showed the opposite effect; the expression of surface markers were increased by the use of LPS, and the more expressed surface markers was the CD54, followed by CD40 and CD14; LPS stimulation increased the production of TNFα and peroxides had the tendency to increase this production, with the exception of higher concentrations, where most of the cells were dead