Geração de blastocisto quimérico pela agregação de trofectoderme com a massa celular interna ou com células iPS

Abstract

Na literatura, não há descrição de que células trofectodérmicas sejam adequadas para a agregação (sem utilizar a fusão ou a microinjeção) e forma cão de embrião quimérico. O presente trabalho buscou validar um modelo para gerar blastocistos quiméricos, pela agrega ção de tecido trofectodérmico, primeiramente validando-o em camundongos e posteriormente testando a sua eficácia na espécie bovina. Nesta, duas técnicas para a reconstrução de blastocistos foram investigadas, mediante a agregação de um fragmento de trofectoderme (TE) com a massa celular interna (MCI) ou com células tronco induzidas a pluripotência (iPS). Os embriões foram bissectados com lâmina, assistida por micromanipulador, exceto no Experimento 1 e 2 (embriões bovinos) em que a bissecação utilizou microlâmina, por em controlada manualmente. De acordo com o delineamento de cada experimento, os embriões, os fragmentos embrionários e/ou as células iPS, foram depositados em micropoços preenchidos com meio KSOMaa (camundongo) ou SOF (gado bovino). Após 24 horas, a taxa de agregação (TA) das estruturas nos micropoços foi avaliada morfologicamente, mediante a detecção de uma única e coesa massa celular ou pela re-expansão e reorganização do blastocisto. Na validação em camundongos, foram utilizados dois hemiblastocistos ou MCI e TE derivados de embriões produzidos in vivo das linhagens Swiss Webster e C57BL/6/EGFP. Três experimentos foram conduzidos para caracterizar: 1) a eficácia da agregação de embriões em estágios pós-compactação; 2) o efeito do aumento de fragmentos embrionários e a utilização de um agente aglutinante biológico (fitohemaglutinina) na agregação; e 3) a exequibilidade da reconstrução do blastocisto pela aproximação entre MCI e fragmento de TE. Na segunda parte do trabalho, foram utilizados embriões bovinos produzidos in vitro em 5 experimentos: 1) utilização de fitohemaglutinina...

There is no report in the literature that trophectoderm cells can be used for aggregation (except in combination with fusion or microinjection techniques) and develop aggregates into a chimeric embryo. We aimed to validate a model to generate chimeric blatocysts using the trophectodermic tissue for aggregation in mice and replicate the validated technique in bovine embryos. We tested two methods of reconstruction in order to aggregate a trophectoderm fragment with either the inner cell mass (ICM) or the induced pluripotent stem (iPS) cells. Embryos were bisected by a blade assisted by micromanipulator, except in experiment 1 and 2 (bovine embryos) in which embryos were bisected by a manually controlled microblade. According to each experimental design, embryos, embryonic fragments and/or iPS cells were deposited in microwells lled with KSOMaa (mice) or SOF (bovine cattle). After 24 h the aggregation rate (AR) was assessed morphologically by the detection of a single, cohesive cell mass or by a re-expanded and reorganized blastocyst. In mice we used two demi-blastocysts or ICM and TE derived from in vivo produced Swiss Webster and C57BL/6/EGFP embryos. Three approaches aimed to characterize: 1) the e ectiveness of aggregation in post-compaction embryos; 2) the e ect on aggregation of increasing embryonic fragments and the use of the cell agglutination agent, phytohemagglutinin-L; and 3) the feasibility of reconstructing blastocysts by culturing ICM and TE fragments in close contact. In the bovine experiment we used in vitro produced embryos in 5 approaches to assess: 1) the effect of phytohemagglutinin-L in the aggregation of post-compaction demi-embryos; 2) blastocyst reconstruction using manually sectioned structures (ICM and TE); 3) microinjection of TE fragments into morula; 4) blastocyst reconstruction using structures (ICM and TE) sectioned with micromanipulator; and 5) production of chimeric ...