Silenciamento epigenético dos genes CRABP2 e MX1 em tumores de cabeça e pescoço

Abstract

O carcinoma de células escamosas de cabeça e pescoço (HNSCC) é uma doença heterogênea que afeta o epitélio da cavidade oral, laringe e faringe. A maioria dos pacientes é diagnosticada em estágios avançados da doença e ainda não existe nenhum marcador sensível e específico para o comportamento agressivo deste tumor. Portanto, uma detecção precoce e biomarcadores de prognóstico são altamente necessárias para uma administração mais racional da doença. A hipermetilação de ilhas CpGs é um dos mecanismos epigenéticos mais importantes que levam a um silenciamento gênico em tumores e tem sido extensivamente utilizados para a identificação de biomarcadores. Neste estudo foram combinados as análises de Rapid Substractive Hybridization (RaSH) e microarray de uma maneira hierárquica para selecionar genes que, supostamente, são reativados pelo agente desmetilante 5`'Aza'2`'deoxicitidina (5Aza'dC) em linhagens celulares derivados de carcinoma de cabeça e pescoço (FaDu, UM' SCC'14A, UM'SCC'17A e UM'SCC'38). Esta análise combinada identificou 78 genes dos quais 35 foram reativados em, pelo menos, 2 linhagens celulares e apresentavam ilha CpG nas suas regiões 5`. A reativação de três destes 35 genes (CRABP2, MX1 e SLC15A3) foi confirmada por PCR em tempo real (Fold change ≥ 3). O seqüenciamento de bissulfito de sódio das suas ilhas CpGs revelou que eles estão, de fato, diferencialmente metilados em linhagens celulares derivadas de carcinoma de cabeça e pescoço. Foram detectadas uma maior freqüência de hipermetilação dos genes CRABP2 (58.1% para a região 1) e MX1 (46.3%) em amostras primárias de câncer de cabeça e pescoço quando comparados a linfócitos de indivíduos saudáveis utilizando o PCR de metilação específica (MSP). Finalmente a ausência da proteína CRABP2 foi associada com...

Head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC) is a heterogeneous disease affecting the epithelium of the oral cavity, pharynx and larynx. Most patients are diagnosed at late stages of the disease and no sensitive and specific predictors of aggressive behavior have been identified yet. Therefore, early detection and prognostic biomarkers are highly desirable for a more rational management of the disease. Hypermethylation of CpG islands is one of the most important epigenetic mechanisms that leads to gene silencing in tumors and has been extensively used for the identification of biomarkers. In this study, we combined Rapid Subtractive Hybridization (RaSH) and microarray analysis in a hierarchical manner to select genes that are putatively reactivated by the demethylating agent 5'aza'2’'deoxycytidine (5Aza'dC) in HNSCC cell lines (FaDu, UM'SCC'14A, UMSCC'17A, UM'SCC'38A). This combined analysis identified 78 genes of which 35 were reactivated in at least 2 cell lines and harbored a CpG island at their 5’ region. Reactivation of three out of these 35 genes (CRABP2, MX1 and SLC15A3) was confirmed by qRT'PCR (fold change ≥ 3). Bisulfite sequencing of their CpG islands revealed that they are indeed differentially methylated in the HNSCC cell lines. Using Methylation Specific PCR (MSP), we detected a higher frequency of CRABP2 (58.1% for region 1) and MX1 (46.3%) hypermethylation in primary HNSCC, when compared to lymphocytes from healthy individuals. Finally, absence of the CRABP2 protein was associated with decreased disease'free survival rates, supporting a potential use of CRABP2 expression as a prognostic biomarker for HNSCC patients