Tipagem molecular, perfis de sensibilidade e caracterização de transcritos diferencialmente expressos durante a infecção de Cryptococcus neoformans

Abstract

Cryptococcus neoformans é patógeno importante, principalmente em pacientes imunocomprometidos. A principal porta de entrada deste patógeno é pela via respiratória, disseminando-se posteriormente e atingindo principalmente o sistema nervoso central, provocando a meningite criptocóccica. A primeira parte deste estudo teve como objetivos determinar, nos 106 isolados clínicos de C. neoformans obtidos de dois Estados (São Paulo e Rio de Janeiro), (1) as variedades e (2) os mating-types por PCR (Polymerase Chain Reaction), (3) analisar a diversidade genética por PCR-fingerprinting com a seqüência iniciadora específica para regiões microssatélite (GACA)4, (4) por RAPD (Random Amplification of Polymorphic DNA) com o iniciador 6 e (5) por PCR-RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) do gene da fosfolipase B (PLB1) digerido com a enzima de restrição AvaI e (6) determinar a sensibilidade a quatro antifúngicos (fluconazol, itraconazol, 5-fluorocitosina e anfotericina B) seguindo o método de referência (documento M27-A2) do CLSI (Clinical and Laboratory Standards Institute). A segunda parte teve como objetivo, analisar transcritos diferencialmente expressos durante a infecção pulmonar de C. neoformans, pela técnica de RDA (Representational Difference Analysis). Entre os 106 isolados, 104 foram identificados como C. neoformans e apenas dois foram C. gattii (=C. neoformans var. gattii), todos MATa. O tipo molecular VNI (C. neoformans var. grubii, sorotipo A) foi o mais prevalente entre os isolados (97/106), seguido do tipo VNII (C. neoformans var. grubii, sorotipo A) (7/106) e VGII (C. gattii, sorotipos B ou C) (2/106) quando analisados por PCR-fingerprinting e PCR-RFLP. Homogeneidade alta foi obtida com o iniciador (GACA)4, com a maioria dos isolados apresentando correlação em torno de 0,9. Os resultados do RAPD, por sua vez, revelaram maior heterogeneidade com número maior de perfis moleculares.

Cryptococcus neoformans is an important pathogen, mainly in immunocompromised patients. The pathogen penetrates mainly by respiratory way, disseminate afterward and reach specially the central nervous system causing the cryptococcal meningitis. The first part of this study had the objective to determine, in the 106 clinical isolates of C. neoformans obtained from São Paulo and Rio de Janeiro State, (1) the varieties and (2) mating-types by PCR (Polymerase Chain Reaction), (3) analyze the genetic diversity by PCR-fingerprinting with specific primer to microsatellite regions (GACA)4, (4) by RAPD (Random Amplification of Polymorphic DNA) with primer 6 and (5) by PCR-RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) of the phospholipase B gene (PLB1) digested with restriction enzyme AvaI and (6) to determine the susceptibility to four antifungal (fluconazole, itraconazole, 5-flucytosine and amphotericin B) following the reference method (document M27-A2) from CLSI (Clinical and Laboratory Standard Institute). The second part had the goal to analyze differentially expressed transcription during pulmonary infection of C. neoformans, by RDA (Representational Difference Analysis) technique. Among 106 isolates, 104 were identified as C. neoformans and only two were C. gattii (=C. neoformans var. gattii), all MATa. The molecular type VNI (C. neoformans var. grubii, serotype A) was the most prevalent among the isolates (97/106), followed by VNII (C. neoformans var. grubii, serotype A) (7/106) and VGII (C. gattii, serotypes B ou C) (2/106) when analyzed by PCR-fingerprinting and PCR-RFLP. High homogeneity was obtained with the primer (GACA)4, with most of the isolates showing correlation around 0.9. By contrast, the RAPD analysis revealed more heterogeneous with more numbers of molecular profiles.