Identificação e caracterização de um gene cry recombinante de Bacillus thuringiensis var. londrina

Abstract

Os países industrializados apresentam uma forte tendência em buscarem, cada vez mais, sistemas de controle biológico eficiente e específicos sendo menos tóxicos para os humanos e o ecossistema em geral. Os bioinseticidas à base de microrganismos entomopatogênicos não encontram grandes restrições quanto a sua utilização. Dentre as bactérias que possuem atividade entomopatogênica, Bacillus thuringiensis é a que apresenta maior valor potencial no controle dos insetos-praga, por apresentar vários genes cry e possuir mecanismos de recombinação genética como: conjugação e transformação. O objetivo desse estudo foi identificar e caracterizar a linhagem B. thuringiensis var. londrina. A análise morfológica dos cristais indica uma nova proteína Cry. Para comparação foram utilizadas as linhagens de B. thuringiensis var. tenebrionis, var. tolworthi e var. kurstaki - HD1 que possuem os genes cry3Aa, cry3Ba e cry1Aa, respectivamente. Foi realizada a extração do DNA total das quatro linhagens, em seguida esse material foi submetido à reação de PCR com os oligonucleotideos iniciadores específicos dos genes acima citado. Para a confirmação dos resultados utilizou-se a técnica de hibridização por Southern blotting e seqüenciamento dos amplicon. O amplicom para o gene cry3 obtido pela linhagem padrão B. thuringiensis var. tenebrionis foi igual ao tamanho esperado, porém o obtido pela linhagem var. londrina foi maior em números de nucleotídeo que o esperado, indicando uma possível recombinação. A técnica de Southern blotting confirmou a recombinação do gene mostrando diferenças entre as bandas das linhagens padrão e da linhagem var. londrina, confirmando assim um novo gene cry3. Os bioensaios executados com esse novo gene não indicaram eficiência para alguns insetos-praga de lavoura da ordem Lepidoptera e foram eficientes...

Industrialized countries show a strong tendency to look for efficient and specific biological control systems that are less toxic to humans and ecosystems. Bioinsecticides based on entomopathogenic microorganisms are well accepted by the public. Among those, bacteria that exhibit such entomopathogenic activities, Bacillus thuringiensis is the one with major potential over the pests, since it harbors several cry genes and holds genetic recombination mechanisms such as bacterial conjugation and transformation in order to accomplish these control procedures. The aim of this research was to identify and characterize the strain of B. thuringiensis var. londrina. As a comparison some other strains of B. thuringiensis such as B. thuringiensis var. tenebrionis, var. tolworthi and var. kurstaki - HD1 that holds the genes cry3Aa, cry3Ba and cry1Aa, were used respectively. Alkaline lysis procedure was used for the DNA extraction from the four bacterial strains followed by its use on PCR reactions using the specific primers for the genes. To confirm the results were utilized the techniques of Southern blotting hybridization and DNA sequencing. The obtained amplicons have shown a difference in size considering the pattern strains compared to the var. londrina. The genetic recombination that took place so as to generate the var. londrina cry gene was detected by Southern blotting analysis, the hybridization results confirm the genetic recombination showing the banding pattern differences that took place generating the new cry3 gene. The bioassays showed that the recombinant gene was efficient to control Sphenophorus levis (Coleopteran).