Sequenciamento de DNA e imunoistoquímica renal para detecção de Leishmania sp em cães

Abstract

A leishmaniose é uma enfermidade provocada por protozoários do gênero Leishmania, que pode produzir manifestações cutâneas, mucocutâneas ou viscerais. Os objetivos deste ensaio foram os de identificar a espécie Leishmania (Leishmania) chagasi, utilizando o método PCR-RFLP em amostras de tecido de cães com leishmaniose visceral; seqüenciar o fragmento amplificado de DNA das amostras de linfonodos de diferentes animais, em busca de homologia e polimorfismos; comparar os métodos de imunoistoquímica e de PCR dos rins, na identificação da Leishmania e comparar as técnicas sorológicas em relação à PCR como auxílio diagnóstico da leishmaniose. Para tanto, foram utilizadas amostras de 48 cães com leishmaniose, diagnosticados por meio de testes IFI, ELISA e por PCR. Realizou-se PCR com amostras de linfonodo poplíteo, baço e rins, utilizando ‘primers’ específicos para o gênero Leishmania. A partir de amostras amplificadas, o DNA foi submetido à digestão enzimática (técnica PCR-RFLP) com as enzimas Hae III, Bsr I e Rsa I. Para o seqüenciamento de DNA, produtos de PCR foram amplificados com ‘primer sense’, precipitados e submetidos ao seqüenciamento automático. Com fragmentos histológicos renais, realizou-se a técnica imunoistoquímica utilizando anticorpo policlonal anti-Leishmania produzido em coelho. O método PCR-RFLP permitiu identificar a espécie Leishmania (Leishmania) chagasi em todas as amostras de DNA dos diferentes tecidos. No seqüenciamento de DNA, os fragmentos amplificados mostraram-se pertencentes às espécies causadoras de leishmaniose visceral, porém não foi possível diferenciá-las. A técnica de imunoistoquímica mostrou presença de formas amastigotas íntegras em meio ao infiltrado inflamatório intersticial em dois (4%) dos 48 animais avaliados, enquanto a PCR confirmou Leishmania sp em 77% dos cães. Conclui-se que a técnica...

Leishmaniasis is a disease caused by organisms belonging to the genus Leishmania. Clinical forms of leishmaniasis are found as being cutaneous, mucocutaneous or visceral. The objectives of the present study were to identify the Leishmania (Leishmania) chagasi species in tissue specimen from dogs presenting visceral disease diagnosed by PCR-RFLP assay; to determine the fragment sequence (120bp) from lymph node samples from different animals searching for homologies and polymorphism; and to compare immunohistochemistry method to PCR assay with renal tissue and Leishmania local identification. Forty eight samples from dogs clinically diagnosed positive to leishmaniasis by IFAT, ELISA and PCR assays were used in this study. The PCR were performed with samples of popliteo lymph node, spleen and kidneys, and specific oligonucleotides to genus Leishmania. PCR products were digested with enzymes Hae III, Bsr I and Rsa I. The nucleotide sequences were determined automatically. For immunohistochemical purposes the sections of kidneys and anti-Leishmania polyclonal antibody were used. PCR-RFLP assay allowed us to identify the Leishmania (Leishmania) chagasi specie in all DNA samples from different tissues samples. DNA sequencing revealed products amplified belonging to specie responsible to cause visceral leishmaniasis, but it was not possible to distinguish the species. The immunohistochemical study revealed the presence of amastigotes organisms on intersticial inflammatory infiltrate from two dogs (4%), while the PCR assay detected the Leishmania sp in 37 dogs (77%). Based on the PCR-RFLP results, we concluded that it characterized as being Leishmania (Leishmania) chagasi species, etiologic agents of visceral leishmaniasis, in this group of animals; DNA sequence presented homology of 55 bp among all Leishmania spp studied. Additionally, the PCR performed... (Complete abstract click electronic access below)