Avaliação dos efeitos da inibição da maturação nuclear e de antioxidantes sobre a maturação oocitária, fecundação e desenvolvimento embrionário bovino in vitro

Abstract

O objetivo deste trabalho foi avaliar os efeitos da suplementação do meio de maturação com roscovitina, butirolactona I, cisteamina e b-mercaptoetanol na maturação oocitária e suas conseqüências na fecundação e desenvolvimento embrionário bovino in vitro, além da variabilidade da freqüência de danos ao DNA embrionário. Oócitos foram maturados a 38,8oC em atmosfera de 5% CO2 em ar em meio TCM-199 suplementado com 0,6% BSA, 0,5 mg FSH, 100 UI hCG e 1 mg estradiol/mL (controle - C), adicionado de 50 æM de cisteamina (CC) ou 50 æM de bmercaptoetanol (CM). O grupo padrão do laboratório (S) foi suplementado com 10% de SFB como fonte protéica. Os oócitos em meio suplementado com butirolactona I ou roscovitina foram pré-maturados por 24 horas em meio TCM-199 suplementado com 0,3% BSA, antibiótico e piruvato, de acordo com os grupos: 100 æM de butirolactona I (CB), 100 æM de butirolactona I + 50 æM de cisteamina (CBC), 100 æM de butirolactona I + 50 æM de b-mercaptoetanol (CBM), 25 æM de roscovitina (CR), 25 æM de roscovitina + 50 æM de cisteamina (CRC) e 25 æM de roscovitina + 50 æM de b-mercaptoetanol (CRM). Após o cultivo de pré-maturação, foram transferidos para gotas com meio controle para maturação por 8, 16 e 24 horas, para avaliação da maturação nuclear e citoplasmática, e dosagem da [GSHi]. A fecundação foi realizada após 24 horas do início do cultivo de maturação (grupos sem inibidores), e 20 horas (grupos com inibidores). O cultivo de desenvolvimento foi realizado em meio SOF-Modificado suplementado com 0,5% de BSA e 2,5% de SFB à temperatura de 38,8ºC por 192 horas. Observou-se que a butirolactona I é capaz de bloquear a maturação meiótica de maneira reversível e mais eficiente que a roscovitina, e que os antioxidantes não interferiram na retomada da maturação nuclear...

The aim of this work was to evaluate the effects of maturation media supplementation with roscovitine, butyrolactone I, cysteamine and - mercaptoethanol on oocyte maturation and the consequences on fertilization and bovine embryo development in vitro, and also DNA damage frequency in embryos. Oocytes were matured at 38.8°C under a 5% CO2 in air environment, in TCM-199 medium supplemented with 0.6% BSA, 0.5 mg FSH, 100 IU hCG and 1 mg estradiol/mL (control group - C) and with either 50 æM cysteamine (CC group) or 50 æM b-mercaptoethanol (CM group). The standard group of the laboratory (S group) was supplemented with 10% FCS as protein source. The oocytes in which groups were pre-incubated for 24 hours with butyrolactone I and roscovitine in TCM-199 medium supplemented with 0.3% BSA, antibiotic and pyruvate were culturedaccording to the groups: 100 æM butyrolactone I (CB), 100 æM butyrolactone I + 50 æM cysteamine (CBC), 100 æM butyrolactone I + 50 æM b-mercaptoethanol (CBM), 25 æM roscovitine (CR), 25 æM roscovitine + 50 æM cysteamine (CRC) and 25 æM roscovitine + 50 æM bmercaptoethanol (CRM). After the pre-incubation, the oocytes were transferred to the control maturation medium for 8, 16 and 24 hours for evaluation of nuclear and cytoplasmic maturation and [GSHi] dosage. For IVF, the oocytes were fertilized at 24 hours after the beginning of maturation (groups without inhibition), or 20 hours (groups with inhibition). Embryo culture was in SOF-Modified medium supplemented with 0.5% BSA and 2.5% FCS at 38.8ºC for 192 hours. We observed that butyrolactone I is capable of reversibly blocking meiotic maturation more effectively than roscovitine, and that addition of antioxidants did not interferewith resumption of nuclear maturation...(Complete abstract, acess undermentioned eletronic address)