Padronização da reação de trans-splicing in vitro em tripanosomas utilizando a técnica de RT-PCR

Abstract

The Trypanosomatidae family includes a large number of protozoan parasites, with importants etiological agents of human diseases. Among the causes of diseases stand out Trypanosoma brucei (responsible for sleeping sickness), Trypanosoma cruzi (Chagas disease causative agent) and Leishmania sp (causing leishmaniasis). These parasites have a mechanism that form their mRNAs, the trans-splicing reaction, which involves the introns (intergenic regions) excision and two exons union of the independent transcripts, RNA SL (spliced leader) and pre-mRNA acceptor. In another laboratory study, the trans-splicing in vitro reaction was established using nuclear extracts (cell-free) from epimastigotes forms of T. cruzi and / or procyclic forms of T. brucei, and as pre-mRNA aceptor was used the alpha tubulin partial sequence (containing the intronic region, splice site and a radiolabelled part of alpha tubulin exon from T. cruzi (unpublished data). The use of radioactive material is a limiting factor, due to its high hazard (extremely harmful to humans and environment), and also by the high cost relative to the current bureaucratic procedures for importation. Therefore, in this work the reaction was reproduced without the use of radioactive material, using the reverse transcription / polymerase chain reaction (RT-PCR) and agarose gel stained with ethidium bromide for analysis of the formed products. The method allows the evaluation of trypanocidal substances interference searching potential therapeutic targets in the parasite ribonucleoprotein, preserving the host cells.

A família Trypanosomatidae compreende um grande número de protozoários parasitas, incluindo importantes agentes etiológicos de doenças humanas. Entre os causadores de doenças, destacam-se Trypanosoma brucei (responsável pela doença do sono), Trypanosoma cruzi (agente causador da doença de Chagas) e Leishmanias sp (causadoras de leishmanioses). Esses parasitas possuem como mecanismo para formação de seus mRNAs, a reação de trans-splicing, que envolve a excisão de íntrons (regiões intergênicas) e a união dos éxons de dois transcritos independentes, SL RNA (spliced leader) e pré-mRNA aceptor. Em outro trabalho realizado no laboratório, a reação de trans-splicing in vitro foi estabelecida utilizando extratos nucleares (livre de células) de formas epimastigotas de T. cruzi e/ou formas procíclicas de T. brucei e como pré-mRNA aceptor, a sequência parcial de alfa tubulina (contendo a região intrônica, splice site e parte do éxon da alfa tubulina) de T. cruzi marcada radioativamente (dados ainda não publicados). O uso de material radioativo é fator limitante, devido a sua alta periculosidade (extremamente nocivo ao homem e ao meio ambiente) e, também, pelo alto custo relativo aos trâmites burocráticos atuais para sua importação. Portanto, neste trabalho reproduziu-se a reação sem o uso de material radioativo, utilizando-se a transcrição reversa/ reação em cadeia da polimerase (RT-PCR) e gel de agarose corado por brometo de etídeo para a análise dos produtos formados. A metodologia permitirá a avaliação da interferência de substâncias tripanocidas, buscando potenciais alvos terapêuticos nas ribonucleoproteínas de parasitas, preservando as células do hospedeiro.