Isolamento viral e diagnóstico molecular de herpevírus canino

Abstract

The canine herpesvirus (CHV-1) causes contagious disease affecting dogs worldwide. It is considered the responsible for cause reproductive problems, respiratory, eyes, neurologic changes may lead to death newborns and immunocompromised adults. Therefore, our study aimed to isolate CHV-1 from biological samples, standardize a diagnostic techniques for the detection of canine herpesvirus, verify the presence of infected dogs in São Paulo state and compare three modifications in the technique of limiting dilution in relation to molecular quantification to qPCR (by quantitative PCR to determine the viral titer). Thus, we collected 139 blood samples, organ´s fragments from 12 neonates death and 5 genital secretions samples with swabs of animals from kennels and households. After obtaining the DNA from samples were accomplished the qPCR (quantitative PCR) and snPCR (seminested PCR) assay for detection of CHV-1. It was found positivity in nine blood sample and organ´s fragments of an animal, the genital secretions samples were all negative. The viral isolation was performed from kidney. The infected cells showed cytopathic effects compatible with the CHV-1. Positive samples were sequenced showed 100% identity with the CHV-1 (Genbank™: X75765). The molecular techniques for detection agent were sensitive and specific, both the snPCR as the qPCR. In these techniques was enabled to detect DNA 15.35 copies/mL of blood samples and 1.15 copies/μg of tissue. The use of molecular techniques allowed the detection active infections of of HCV-1 with optimal detection limit. More studies are needed to understand the infection epidemiology of CHV-1 in the canine population in Brazil

O herpesvírus canino (HVC-1) causa doença infecto-contagiosa que acomete cães em todo o mundo. É considerado o responsável por causar problemas reprodutivos, respiratórios, oculares, alterações neurológicas podendo levar à morte neonatos e adultos imunossuprimidos. Assim, o presente trabalho teve como objetivos isolar o HVC-1 a partir de amostras biológicas, padronizar uma técnica diagnóstica para detecção do herpesvírus canino, verificar a presença de cães infectados no estado de São Paulo e comparar 3 modificações na técnica de diluição limitante em relação à quantificação molecular pela qPCR (quantitative Polymerase Chain Reaction). Para isso, foram coletadas 139 amostras sangue, fragmentos de órgãos de 12 neonatos que foram a óbito e 5 amostras de suabes de secreção genital, de animais provenientes de canis e domicílios. Após a obtenção do DNA das amostras colhidas, foram submetidas à qPCR e snPCR (seminested Polymerase Chain Reaction) para o teste de detecção do HVC-1. Foi encontrada positividade em nove foram amostras de sangue e em fragmentos de órgãos de um animal, as amostras de secreções genitais foram todas negativas. O isolamento viral foi realizado a partir de fragmento de rim. As células infectadas apresentaram efeitos citopáticos compatíveis com as do HVC-1. As amostras positivas foram sequenciadas apresentando identidade de 100% com o HVC-1 (Genbank ™: X75765). As técnicas moleculares para a detecção do agente mostraram-se sensíveis e específicas, tanto a snPCR como a qPCR. Nessas técnicas foi possível detectar até 15,35 cópias/ μL de DNA de amostras de sangue e 1,15 cópias/μg de tecido. O uso de técnicas moleculares possibilitou a detecção de infecções ativas por HVC-1 com ótimo limiar de detecção. No entanto, mais estudos são necessários para conhecer a epidemiologia da infecção do HVC-1 na população canina no Brasil