Expressão de fatores relacionados à morte celular programada em embriões bovinos infectados com BHV-5

Abstract

It is known that some pathogens can initiate apoptosis in certain cells of the organism, however, BHV-5 inhibits apoptosis in bovine embryos after seven days of development. Therefore, the aim was to investigate the interaction virus-embryo in the mechanism of programmed cell death. Bovine oocytes were divided into two groups: I (control) and II (exposed to BHV-5). After 24 hours of in vitro maturation, 100 oocytes of each group were denuded and observed under inverted microscope to check the extrusion of the first polar body, and the other oocytes were incubated with spermatozoa for 18 to 20 hours, for in vitro fertilization. After this period, presumptive zygotes were denuded and transferred to drops containing culture medium (mSOF), until day seven postfertilization. In vitro produced embryos were submitted to real time PCR to evaluated the presence of BHV-5 and expression of Mcl-1, Bax, caspase-2, -3 and Apaf-1 related to apoptosis, also the MTT assay ((3 - [4,5-dimethylthiazol 2-yl] -2,5-diphenyl tetrazolium bromide)) was performed for the evaluation of mitochondrial activity. Statistical analysis for nuclear maturation of oocytes was performed by x2 test. In vitro embryo production, MTT and gene expression were analyzed by unpaired t test. It was observed that BHV-5 did not influence nuclear maturation rate of oocytes or embryonic development, however embryos of group I showed greater mitochondrial viability, and embryos of group II had a decrease in genes expression of Bax and caspase-2, suggesting that the virus inhibited the process of programmed cell death in bovine embryos seven days post-fertilization, in order to promote viral spread

É sabido que alguns patógenos podem desencadear o processo de apoptose em determinadas células do organismo, entretanto, o BHV-5 inibe a apoptose em embriões bovinos com sete dias de desenvolvimento. Por esta razão, o objetivo deste trabalho foi investigar a interação vírus-embrião no mecanismo de morte celular programada. Oócitos bovinos foram divididos em dois grupos, sendo: I (controle) e II (exposto ao BHV-5). Após 24 horas de maturação in vitro, 100 oócitos de cada grupo foram desnudados e observados em microscópio invertido para verificação da extrusão do primeiro corpúsculo polar, sendo o restante dos oócitos incubados com espermatozoides, por 18 a 20 horas, para que ocorresse o processo de fertilização in vitro. Transcorrido este período, os prováveis zigotos foram desnudados e transferidos para gotas contendo meio de cultivo (mSOF), até o dia sete pós-inseminação. Os embriões produzidos in vitro foram submetidos à técnica de PCR em tempo real para pesquisa do BHV-5 e análise da transcrição dos genes Mcl-1, Bax, caspase-2, -3 e Apaf-1 relacionados à apoptose, além do teste de MTT ((3-[4,5dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyl tetrazolium bromide)), para avaliação da atividade mitocondrial. A análise estatística para a taxa de maturação nuclear dos oócitos foi feita pelo teste de x2. A produção in vitro de embriões, MTT e transcrição gênica foi avaliada pelo teste t não pareado. Observou-se que o BHV-5 não interferiu na taxa de maturação nuclear dos oócitos e no desenvolvimento embrionário, entretanto os embriões do grupo I apresentaram maior viabilidade mitocondrial e os embriões do grupo II tiveram a expressão dos genes Bax e caspase-2 diminuídos, comprovando que o vírus inibiu o processo de morte celular programada nos embriões bovinos sete dias pósinseminação, a fim de favorecer a disseminação viral