Clonagem e expressão do gene engXCA de Xanthomonas campestri pv. campestris em Saccharmyces cerevisiae e estudos das endoglucanases nativa e recombinante

Abstract

The dependence on highly polluting fossil sources of energy, such as oil and oil products, has led the society to look for alternatives for renewable fuel use. Current researches indicate as emerging technology the production of fuel ethanol from lignocellulosic biomass waste. With the development and the establishment of new technologies for obtaining second-generation ethanol, cellulases may become the first class of enzymes marketed and industrially used worldwide. Despite being produced by a range of microorganisms, there are still limitations that hinder the process to obtain these enzymes. In order to overcome some of these difficulties, molecular biology appears as a favorable enzyme production tool. Since cloning and expression of cellulase genes in yeasts represents a interesting strategy for using these enzymes in simultaneous saccharification and fermentation (SSF) process. Within this context, this study aimed the construction of a yeast strain capable of expressing a bacterial cellulase for future testing of SFS. To this end, engXCA gene was isolated from Xanthomonas campestris pv. campestris (Xcc), and a gene fragment coding for the signal peptide of the alpha factor Sc (MFalpha). The latter was connected upstream to engXCA gene, resulting in MFalpha-engXCA merger. This chimera was linked to vector pYES2 Saccharomyces cerevisiae (Sc) and the recombinant expression endoglucanase was secreted into the culture medium. The strain that showed the best production of the recombinant enzyme was Sc BJ3501. When growing for 36 h at 30°C, in rich medium YPGal + CMC (carboxymethyl cellulose) 1.0%. The reaction conditions were evaluated for both native and Xcc recombinant endoglucanases and the best conditions for enzymatic activities were pH 5.5 and 65°C. Regarding stability, recombinant and native endoglucanases were more stable at pH 5.0 and maintained a high thermostability up to 55 °C when incubated for 1 hour.

A grande dependência de fontes fósseis de energia altamente poluentes, como o petróleo e seus derivados, tem levado a sociedade a buscar alternativas renováveis para a utilização de combustíveis. As pesquisas atuais sinalizam como tecnologia emergente a produção de etanol combustível a partir de biomassas residuais de composição lignocelulósica. Com o desenvolvimento e o estabelecimento de novas tecnologias para a obtenção de etanol de segunda geração, as celulases podem tornar-se a primeira classe de enzimas comercializadas e industrialmente utilizadas no mundo todo. Mesmo sendo produzidas por uma gama de micro-organismos, ainda há restrições que dificultam o processo de obtenção destas enzimas. Para superar algumas destas dificuldades, a Biologia Molecular surge como uma ferramenta favorável na produção enzimática, pois a clonagem e expressão de genes de celulases em leveduras representa uma estratégia interessante para a utilização das mesmas em processos de sacarificação e fermentação simultâneos (SFS). Dentro deste contexto, o presente estudo teve como objetivo a construção de uma linhagem de levedura capaz de expressar uma celulase bacteriana para testes futuros de SFS. Para tal, foi isolado o gene engXCA de Xanthomonas campestris pv. campestres (Xcc) e um fragmento do gene codificando para o peptídeo sinal do fator alpha de Saccharomyces cerevisiae (Sc) (MFalpha). Este foi ligado upstream ao gene engXCA, resultando na fusão MFalpha-engXCA. Tal quimera foi ligada ao vetor de expressão pYES2 de Sc e a endoglucanase recombinante foi secretada para o meio de cultivo. A linhagem que apresentou melhor produção da enzima recombinante foi Sc BJ3501 quando cultivada por 36h a 30°C, em meio rico YPGal+CMC (carboximetilcelulose) 1,0%. As condições reacionais foram avaliadas tanto para a endoglucanase recombinante quanto para a selvagem de Xcc e, as melhores condições para as atividades enzimáticas foram...