Efeitos do diâmetro oocitário, configuração da cromatina em VG e avaliação da atividade quinase p34cdc2 na maturação in vitro de oócitos caninos

Abstract

The aim of this study was to evaluate the influence of stages of anestrus and diestrus in oocyte diameter, configuration of chromatin in GV stage and competence of canine oocytes, as well as analyze the kinetics of p34cdc2 kinase activity during in vitro maturation of canine oocytes after 24, 48 and 72 hours of in vitro culture. Ovaries were obtained from bitches after elective ovariohysterectomy (OSH). To evaluate the diameter and configuration of chromatin in GV stage, cumulus-oocyte complexes (COCs) were subjected to 0,2% hyaluronidase solution for removal of cumulus cells and stained with Hoechst. The assessment of nuclear configuration of canine oocytes was analysed after 72 hours in vitro maturation. To perform the ELISA was performed an extract of proteins from oocytes after 24, 48 and 72 hours of in vitro culture. For the mean oocyte diameter, the results showed no difference (p> 0.05) between phases of anestrus and diestrus (77,62 μm x 78,64 μm). Comparing the reproductive phases, higher frequency of oocytes in stages of MI (19,1%) and M-II (14%) was observed in the diestrus phase. However, these differences were not significant (p> 0.05). Four stages of chromatin configuration identified as GV-1, GV-2, GV-3 and GV-4 were classified. The observed changes in chromatin configuration been characterized as a transition dispersed chromatin (GV-1, GV-2) for partially condensing (GV-3) until it reaches a fully condensed phase (GV-4). The results showed difference (p<0.05) between phases of anestrus and diestrus, with a higher proportion of GV-1 and GV-2 during anestrus and GV-3 and GV-4 during diestrus. The p34cdc2 kinase activity was shown to be time-dependent, reaching a peak at 48h of IVM (p<0,001). After 72h, the activity showed a decrease. Thus, identification of factors related to the resumption and progression of meiosis in vivo is critical for making appropriate adjustments and improvement of culture conditions

O objetivo deste estudo foi avaliar a influência das fases de anestro e diestro no diâmetro oocitário, na configuração da cromatina em VG e na competência de oócitos caninos, assim como analisar a cinética da atividade quinase p34cdc2 durante a maturação in vitro de oócitos caninos após 24, 48 e 72 horas de cultivo in vitro. Os ovários foram obtidos de cadelas submetidas à ovário-salpingo-histerectomia eletiva (OSH). Para avaliar o diâmetro e a configuração da cromatina em VG, os complexos cumulus-oócitos (COCs) foram submetidos à solução de hialuronidase 0,2% para a remoção das células do cumulus e corados com Hoechst. A avaliação da configuração nuclear dos oócitos caninos foi realizada após 72h de maturação in vitro. Para a realização do ELISA, foi realizado um extrato de proteínas dos oócitos após 24, 48 e 72 horas de cultivo in vitro. Quanto ao diâmetro médio oocitário, os resultados não demonstraram diferença (p>0,05) entre as fases de anestro e diestro (77,62 μm x 78,64 μm). Comparando-se as fases reprodutivas, maior frequência de oócitos nos estágios de M-I (19,1%) e M-II (14%) foi observada na fase de diestro. Entretanto, essas diferenças não foram significativas (p>0,05). Foram classificados quatro estágios de configuração da cromatina identificados como VG-1, VG-2, VG-3 e VG-4. As alterações observadas na configuração da cromatina foram caracterizadas como, transição de uma cromatina dispersa (VG-1, VG-2) para parcialmente condensada (VG-3) até atingir um estágio totalmente condensado (VG-4). Os resultados evidenciaram diferença (p< 0,05) entre as fases de anestro e diestro, com maior proporção de VG-1 e VG-2 durante o anestro e de VG-3 e VG-4 durante o diestro. A atividade quinase p34cdc2 mostrou-se tempo-dependente, atingindo o pico máximo em 48h de MIV (p<0,01). Após 72h, a atividade demonstrou um decréscimo. Dessa forma, a identificação de fatores ...