Abordagens biossintéticas em piper tuberculatum auxiliada pela síntese de precursores fenilpropanoídicos

Abstract

The increase in demand for discovery of new drugs from plant origin has led also to increase organic studies to elucidate the metabolic pathway of the secondary metabolites of interest. Often, these metabolites show low concentration in plant as well structural and configurational complexity distinguishes them from synthetic products and prohibit their synthesis or semi - synthesis. Thus, understanding the biosynthetic processes involved in their formation can facilitate to obtain them by biotechnology techniques. Therefore, the Piper tuberculatum species known to accumulate piperidinic, piperidonic and isobutyl amides that show potential antitumoral, acaricidal, antifungal and insecticidal activities, is set in an excellent model for such functional studies. From leaves and fruits extract two compounds were isolated, the piperine and piplartine, main amides found in Piper tuberculatum. The synthesis of phenylpropanoids precursors: 3'-4'- methylenedioxycynamic acid and ferulic acid as well the same compounds labeled with stable isotopes: acid [1 -OD , 2- D]-3'-4'- methylenedioxycynamic acid and [1 -OD , 2- D]- ferulic acid were performed for the biosynthetic studies. The precursors, L–lysine, 3'-4'- methylenedioxycynamic acid and malonic acid were incorporated in the soluble enzyme fraction of Piper tuberculatum. The optimum conditions for extraction of the enzyme were based on three parameters; temperature (31 ° C), time of reaction (90 minutes) and concentration of precursors (10 mM). The products were analyzed by liquid chromatography and mass spectrometry. The analyzes were monitored using piperine as standard and its formation was determined. For determination of protein concentration the Bradford method was used. The analyze of the proteins was performed by using one-dimensional electrophoresis (SDS- PAGE).

O aumento na demanda pela descoberta de novos fármacos de origem vegetal levou os químicos orgânicos a intensificarem estudos para a elucidação da rota metabólica de formação dos metabólitos de interesse. Muitas vezes, esses metabólitos mostram baixo acúmulo nas matrizes vegetais e/ou apresentam complexidade estrutural, que impossibilitam a obtenção dos mesmos por síntese ou semi-síntese. Com isso, o entendimento dos processos biossintéticos envolvidos em sua formação pode facilitar a obtenção dos mesmos por técnicas biotecnológicas. Para tanto, a espécie Piper tuberculatum, conhecida por acumular amidas piperidínicas, piperidônicas e isobutílicas, com potenciais atividades antitumoral, carrapaticida, antifúngica, inseticida entre outros, se configura em um excelente modelo para tais estudos funcionais. À partir do extrato de folhas e frutos foram isoladas as amidas piplartina e piperina, majoritárias na planta. A síntese dos precursores fenilpropanoídicos: ácido 3’,4’-metilenodióxicinâmico e ácido ferúlico, bem como os mesmos marcados com isótopos estáveis: ácido [1-OD, 2-D]-3’,4’-metilenodióxicinâmico e ácido [1-OD, 2-D]-ferúlico, foi realizada para os estudos biossintéticos. Os precursores, L-lisina, ácido 3’,4’-metilenodióxicinâmico e ácido malônico foram incorporados na fração solúvel do extrato enzimático das folhas de Piper tuberculatum. Foram determinadas as condições ótimas de extração da enzima baseadas em três parâmetros; temperatura (31 °C), tempo de reação (90 minutos) e concentração de precursores (10 mM). Os produtos formados foram avaliados por cromatografia líquida e espectrometria de massas. As análises foram monitoradas utilizando a piperina como padrão, observando a sua formação. Para a determinação da concentração protéica foi utilizado o método de Bradford e a análise das proteínas presentes foi feita utilizando gel de eletroforese...