Caracterização do gene chi_l555 e propriedades bioquímicas da quitinase de Bacillus thuringiensis

Abstract

Bacillus thuringiensis é uma bactéria que pode conferir patogenicidade a uma ampla variedade de insetos, e que possui fatores associados à mortalidade de insetos por B. thuringiensis, que foram identificados e são utilizados no controle de insetos-praga como, por exemplo, as toxinas Cry, Vip e Cyt. Novos genes de B. thuringiensis que possam estar envolvidos no processo de patogenicidade a insetos têm sido identificados, entre estes, as quitinases. Enzimas capazes de hidrolisar as ligações glicosídicas entre as unidades de N-acetil-glicosamina da quitina, e aparecem como uma interessante opção por também mostrarem potencial para serem utilizadas no controle de pragas. No presente trabalho, realizou-se o isolamento e a caracterização de um gene de quitinase do isolado de B. thuringiensis I_555 (chi_I555) e a produção e caracterização parcial da quitinase (Chi_I555). A análise de chi_I555 indicou uma fase de leitura aberta de 2025 pares de bases que codificam uma proteína com 674 aminoácidos e peso molecular de 74,24 kDa. Análises bioinformáticas indicaram a presença de um sítio ativo de quitinase, de um domínio de fribronectina e de um domínio ligante de quitina na proteína Chi_I555. A expressão heteróloga de Chi_I555 resultou na produção de uma quitinase ativa sobre o substrato “Chitin Azure” em uma faixa ótima de pH próxima do neutro. A proteína Chi_I555 utilizada neste estudo é altamente promissora para o uso em construções de plantas geneticamente modificadas

Bacillus thuringiensis is a bacterium that can confer pathogenicity to a wide variety of insects, and has associated with mortality of insects by B. thuringiensis factors that have been identified and are used to control insect pests such as the Cry toxins, Vip and Cyt. New genes of B. thuringiensis that may be involved in the pathogenic process of insects have been identified among these chitinases. Enzymes capable of hydrolyzing glycosidic linkages between the units of N-acetyl-glucosamine from chitin, and appear as an interesting option to also show potential for use in pest control. In this study, we carried out the isolation and characterization of a chitinase gene from B. thuringiensis isolate I_555 (chi_I555) and the production and partial characterization of a chitinase (Chi_I555). Chi_I555 analysis indicated an open reading frame of 2025 base pairs encoding a protein of 674 amino acids and a molecular weight of 74.24 kDa. Bioinformatics analysis indicated the presence of an active site of chitinase, a fribronectin domain and a chitin binding domain of the protein Chi_I555. Heterologous expression of Chi_I555 resulted in the production of an active chitinase on the substrate Chitin Azure in a great range of pH close to neutral. The Chi_I555 protein used in this study is highly promising for use in construction of genetically modified plants