Produção de anticorpos monoclonais murinos dirigidos contra células-tronco mesenquimais de coelho

Abstract

Mesenchymal stem cells (MSCs) are a heterogeneous population of cells that proliferate in vitro as plastic-adherent cells, have fibroblast-like morphology and can differentiate into bone, cartilage and fat cells. Therapeutic potential of MSCs have been studied in experimental models, such as rabbit, in Laboratory of Cell Engineering of Botucatu. However, no specific markers have been reported for expanded rabbit MSCs, which hampers the isolation of pure MSC populations by immunophenotypic characterization. Thus, the objective of this study was to produce monoclonal antibodies (mAbs) to rabbit MSCs. MSCs derived from rabbit bone marrow (BM) were isolated, cultured, expanded ex vivo, and immunized into three BALB/c mices, and spleen cells subsequently harvested were used to generate hibridoma cell lines secreting antibodies against MSCs. Hybridoma cells were screened by flow cytometry and antibody-producing cells were subjected to subsequent rounds of retests. MSC1-160 obtained the best positivity for IgG expression and was cloned by limiting dilutions and micromanipulation. Ascitic fluid from ten best clones was purified by affinity chromatography in Protein A-sepharose CL-4B column and purification control was performed by electrophoresis in agarose gels. The purified IgG were tested against rabbit MSCs, obtaining high positivity by flow Cytometry. In conclusion, we developed 10 mAbs, MSC1-160 A20, A30, A41, A47, A55, A60, A63, A69, A81, and A82, that recognize rabbit MSC cell surface antigens showing potential for immunophenotypic characterization of rabbit MSC cell lines

Células-tronco mesenquimais (CTM) são células-tronco adultas multipotentes de população celular heterogênea que se proliferam in vitro como células aderentes ao plástico de cultura, de morfologia fibroblastóide e capazes de se diferenciar em células da linhagem mesodermal como osteócitos, condrócitos e adipócitos. O potencial terapêutico de CTMs vem sendo estudado em modelos experimentais, como o coelho, no Laboratório de Engenharia Celular de Botucatu. No entanto, ainda não foram relatados marcadores de superfície específicos para tais células, o que impossibilita o isolamento de linhagens de CTMs de coelho por caracterização imunofenotípica. O fato anterior é a justificativa da realização deste projeto cujo objetivo deste estudo foi produzir anticorpos monoclonais contra CTMs de coelho. Células-tronco mesenquimais (CTM) derivadas de medula óssea (MO) de coelho foram isoladas, cultivadas e expandidas ex vivo. As CTMs de MO foram imunógenos para três camundongos da linhagem isogênica BALB/c e os esplenócitos obtidos foram fusionados com células de mieloma múltiplo murino linhagem NS1 gerando hibridomas secretores de anticorpos contra CTMs. Os hibridomas obtidos foram selecionados por citometria de fluxo e as células produtoras de anticorpos foram retestadas. O híbrido MSC1-160 obteve a maior reatividade tendo sido clonado pela técnica de diluição limitante e micro manipulação. Após expansão clonal foi produzido líquido ascítico dos 10 melhores clones. Estas amostras foram purificadas por cromatografia de afinidade à proteína A-sepharose em coluna CL-4B e o controle de purificação realizado por eletroforese em gel de ágar a 1%. O isótipo identificado foi IgG para todos os 10 clones que mantiveram alta reatividade por citometria de fluxo contra CTMs de coelho. Os 10 anticorpos monoclonais murinos obtidos e caracterizados receberam a denominação... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo)