Amplificação, clonagem e sequenciamento de promotores de café (Coffea arabica cv Mundo Novo) específicos de fruto e ubíquos

Abstract

The Coffee Genome Project made available to the scientific community relevant information that made practical the identification and cloning of important genes, as well as the identification of the major sequences involved on their regulation. The aim of the present study was to amplify, clone and sequence coffee promoters with specific expression patterns. For that, coffee ESTs which known expression profiles were employed. First, the promoter regions of coffee genes showing, respectively, fruitspecific and ubiquitous expression were amplified using the Genome Walking strategy. Amplified sequences were then inserted in the pGEM-Teasy vector (Promega) and sequenced. Once completed the sequencing, an expression cassette was constructed using the binary vector pCAMBIA-1381z (Cambia). These expression cassettes were cloned into Agrobacterium tumefaciens, and transgenic tobacco plants were generated aiming the functional characterization of these promoters

O projeto genoma do café disponibilizou para a comunidade científica uma série de informações que têm viabilizado a identificação e clonagem de genes de interesse bem como a identificação das principais seqüências envolvidas na regulação dos mesmos. Utilizando-se de etiquetas de seqüências expressas (EST) de café com padrão de expressão característico, o presente projeto teve como objetivo realizar a amplificação, clonagem e seqüenciamento de promotores de café. Num primeiro momento, as regiões promotoras de um gene com expressão específica em fruto de café e de outro com expressão ubíqua foram amplificadas por meio da técnica de Genome Walking, e os produtos resultantes inseridos no vetor pGEM-Teasy (Promega), para posterior seqüenciamento. Uma vez concluído o seqüenciamento dos clones obtidos, iniciou-se a construção dos cassetes de expressão no vetor pCAMBIA-1381z (Cambia). Os fragmentos promotores foram clonados em fusão transcricional com o gene repórter uidA (GUS) visando a posterior caracterização funcional dos mesmos. Os cassetes de expressão obtidos foram então inseridos em Agrobacterium tumefacis, e em seguida em plantas de tabaco visando os estudos funcionais