Produção de vetores recombinantes para expressão de diferentes formas da proteína K1 do herpesvírus associado ao Sarcoma de Kaposi (KSHV)

Abstract

Kaposi´s sarcoma associated herpesvirus (KSHV) or human herpesvirus 8 (HHV-8) is a gammaherpesvirus essential for the development of all forms of Kaposi´s sarcoma (KS). The KSHV’s life cycle is basically divided into latent and lytic phases, which have distinct viral gene expression profiles. Some important oncogenic products of KSHV are expressed during the lytic phase, including the viral K1 protein. As an effect of interfer-ence with intracellular signaling, K1 expression increases proliferation and survival of KSHV-infected cells. Due to its high level of genetic variability compared to other re-gions of the viral genome, the K1-encoding ORF (ORF-K1) is commonly evaluated for KSHV genotyping. It remains unclear whether different viral genotypes have particular biological effects that might modify the KSHV oncogenicity. The present study aimed to contribute to the establishment of an experimental in vitro model for evaluation of the K1 protein from common KSHV genotypes. Recombinant expression vectors with the ORF-K1 from KSHV genotypes A, B and C were prepared by genetic cloning. The recombi-nant vectors pKSHVOK1 obtained by cloning were sequenced for structural validation. After that, HEK293 cell line was transfected with the recombinant vectors, and proteins were extracted for expression analysis by Western blot technique, for K1 functional vali-dation. Results showed that ORF-K1 vectors containing KSHV ORF-K1 from the A, B and C genotypes were produced and structurally validated by DNA sequencing. The K1 expression at the protein level was also confirmed by immunoblots using an antibody for FLAG detection, an epitope from the vector that binds to K1. Based on presented re-sults, it´s possible to conclude that the recombinant vectors will be able to be used in future studies of K1 protein biological properties from distinct KSHV genotypes

O herpesvírus associado ao sarcoma de Kaposi (Kaposi´s sarcoma associated Herpesvirus - KSHV), ou herpesvírus humano tipo 8 (Human herpesvirus 8 - HHV-8), é um gamaherpesvírus associado ao desenvolvimento de todas as formas de sarcoma de Kaposi (SK). O ciclo biológico do KSHV é tradicionalmente dividido em duas fases de expressão gênica, denominadas latência e ciclo lítico. Dentre os produtos virais ex-pressos predominantemente durante ciclo lítico destaca-se a proteína K1, a qual au-menta sobrevivência e proliferação da célula infectada em virtude de interferência em vias de transdução de sinais intracelulares. Por apresentar elevada variabilidade em relação aos outros segmentos do genoma viral, a ORF-K1 é comumente analisada em estudos de genotipagem do KSHV. Até o momento não se sabe se diferentes genóti-pos do vírus apresentam características biológicas peculiares, que possam modificar o potencial cancerígeno desse vírus. Com o intuito de contribuir no estabelecimento de modelo experimental para análise dos efeitos biológicos da expressão de diferentes formas de proteína K1 do KSHV, no presente estudo efetuou-se a preparação de veto-res de DNA recombinantes contendo a ORF-K1 do KSHV de genótipos A, B e C em-pregando métodos de clonagem. Os vetores recombinantes pKSHVOK1 foram então submetidos a sequenciamento, para validação de sequências de K1 de genótipo A, B e C do KSHV. Em seguida, células HEK293 foram transfectadas e, para validar os veto-res produzidos quanto à expressão da ORF-K1 em nível proteico, lisados das células transfectadas foram analisadas por técnica de Western blot (WB). Os resultados mos-traram que vetores recombinantes contendo a ORF-K1 do KSHV dos principais genóti-pos virais (A, B e C) foram produzidos e validados estruturalmente por sequenciamento automatizado de DNA. Já a expressão proteica de K1 foi constatada por immunoblots ...