Estudo das interações entre proteína NS1 do hRSV e flavonóides utilizando métodos biofísicos

Abstract

Human Respiratory Syncytial Virus (hRSV) is the major cause of acute respiratory infections in children, like bronchiolitis and pneumonia. This Paramyxovirus has a single strand RNA with 10 genes that codify 11 proteins. An important factor that contributes for the success hRSV replication is the immune system evasion, process wich Non-Structural Protein 1 (NS1) is involved. This protein can act by inhibiting or neutralizing steps of interferon type I pathway, as well as, by silencing the ribonucleoproteic complex of hRSV. The knowledge of NS1 protein interaction with ligands is important in the search for molecules that could interfere with protein function and hence result in a reduction of hRSV replication among them the flavonoids have been reported to be effective in suppressing viral replication. The aim of this study includes expression and purification of NS1 protein, characterization of its secondary structure and thermal stability through circular dicroism and perform fluorescence spectroscopy interaction study between NS1 and Quercetin. NS1 purification was performed using affinity resin coupled to a liquid cromatograph ÄKTA (GE HEALTHCARE LIFE SCIENCES). Circular dicroism spectra and thermal denaturation were carried out to investigate NS1 secondary structure and stability. Through fluorescence spectroscopy titration results it has been calculated the Stern Volmer constant (Ksv), the binding (Kb) constant and number of ligands per site (n). CD analysis shown that secondary structure composition of NS1 is 75% alpha-helix; 3% beta-sheet; 10% turn and 12% others and, melting temperature of NS1 is around 65°C. Fluorescence results shown that Ksv and Kb were in order of 104 and 105-106M-1, respectively. Ksv dependence with temperature indicates that the interaction between NS1 and quercetin is dynamic. The results suggest that this interaction may potentially contribute to block the xiii protein function and thus quercetin may ...

O Vírus Respiratório Sincicial Humano (hRSV) é a principal causa de infecções respiratórias agudas em crianças, como bronquiolite e pneumonia. Este Paramyxovirus tem um RNA de fita simples, com 10 genes que codificam 11 proteínas. Um fator importante que contribui para o sucesso da replicação do hRSV é a evasão do sistema imune, processo no qual a proteína não estrutural 1 (NS1) está envolvida. Esta proteína pode atuar por meio da inibição ou neutralização das etapas da cascata do interferon do tipo I, bem como, pelo silenciamento do complexo ribonucleoproteico do hRSV. O conhecimento da interação da proteína NS1 com ligantes é importante na busca de moléculas que possam interferir na função da proteína e consequentemente resultar na redução da replicação do hRSV dentre os quais os flavonóides têm sido descritos como sendo supressores eficazes da replicação viral. Os objetivos deste estudo incluíram a expressão e purificação da proteína NS1, a caracterização da estrutura secundária e estabilidade térmica por dicroísmo circular e a realização do estudo de interação entre NS1 e quercetina por espectroscopia de fluorescência. Foi realizada a purificação da proteína NS1 em resina de afinidade utilizando cromatógrafo líquido ÄKTA (GE HEALTHCARE LIFE SCIENCES). As medidas de dicroísmo circular (CD) permitiram calcular a porcentagem de estruturas secundárias e a temperatura de melting da NS1. A partir das análises das titulações por fluorescência foram calculados a constante de Stern Volmer (Ksv), a constante de ligação (Kb) e o número de ligantes por sítio (n). Os resultados de CD mostraram que a composição da estrutura secundária de NS1 é de 75 % de alfa-hélice, 3% de folha-beta, 10% de voltas e 12% de outras estruturas e a temperatura de melting da NS1 é de cerca de 65°C. Os resultados de fluorescência mostraram que Ksv e Kb foram da ordem de 104 e 105-106M-1, ...