Caracterização funcional do fator da tradução eIF5A por meio de interações genéticas

Abstract

The translation factor 5A (eIF5A) is highly conserved in arqueas and eukaryotes and essential for cell viability. eIF5A is the only protein known to contain the essential amino acid hypusine, generated by a post-translational modification known as hypusination which occurs in two enzymatic steps catalyzed by the enzymes deoxyhypusine synthase (DYS1) and deoxyhypusine hydroxylase (Lia1) enzymes. Although eIF5A has been implicated with the elongation step of translation, its specific function and the role of the hypusine residue is still unknown. For this purpose, this work further characterized the dys1-1 mutant, a conditional mutant of the deoxyhypusine synthase. The results revealed that the dys1-1 mutant shows a polysome profile defect characteristic of translation elongation factors, decrease of eIF5A binding to the polysome fractions and reduction of the total protein synthesis rate. Furthemore, genetic interaction analyses of eIF5A driven by hypotheses, from published and previous data obtained in our laboratory, were performed and revealed synthetic lethality between ASC1 mutants and the dys1-1 mutant and negative genetic interactions (synthetic sick) between the tif51A-1 mutant and mutants of genes related with secretion, specifically those involved with the co-translational translocation of proteins into the endoplasmic reticulum. Finally, high throuput genetic interaction analyses by Synthetic Genetic Array (SGA) were carried out using different eIF5A mutants and two S. cerevisiae mutant strain collections (deletion strains and temperature-sensitive mutants). The results showed, respectively, 338 and 239 genes of the deletion mutant and the temperature-sensitive mutant collections interacting with eIF5A mutants. A total of 577 positive and negative genetic interactions were observed. Moreover, the gene ontology analysis revealed genes involved with cell cycle (53%), DNA repair (18%), translation (16%) and vesicular trafficking/...

O fator da tradução 5A (eIF5A) é altamente conservado em arqueas e eucariotos e essencial para a viabilidade celular. eIF5A é a única proteína conhecida que contém o aminoácido essencial hipusina, gerado através de uma modificação pós-traducional conhecida como hipusinação e que ocorre em duas etapas enzimáticas catalisadas pelas enzimas desoxi-hipusina sintase (Dys1) e desoxi-hipusina hidroxilase (Lia1). Apesar de eIF5A ter sido relacionada recentemente com a etapa da elongação da tradução, a função específica de eIF5A nesse processo, bem como o papel do resíduo de hipusina ainda não estão descritos. Com esse intuito, este trabalho aprofundou inicialmente a caracterização do mutante dys1-1, mutante condicional da enzima desoxi-hipusina sintase. Os resultados revelaram que o mutante dys1-1 apresenta defeito no perfil polissomal característico de fatores que atuam na etapa da elongação da tradução, diminuição da ligação de eIF5A nos polissomos e redução dos níveis de síntese proteica total. Além disso, foram realizadas análises de interação genética envolvendo eIF5A e dirigidas por hipóteses, à partir de dados já publicados ou resultados obtidos previamente pelo laboratório. Nestas análises foi identificada letalidade sintética entre mutantes de ASC1 e o mutante dys1-1, assim como interações genéticas negativas (synthetic sick) entre o mutante tif51A-1 e mutantes de genes relacionados com secreção, mais especificamente com a translocação de proteínas para o retículo endoplasmático pela via co-traducional. Finalmente, foram realizados rastreamentos de interações genéticas em larga escala por Synthetic Genetic Array (SGA), utilizando diferentes mutantes de eIF5A e duas coleções de linhagens mutantes de S. cerevisiae (linhagens nocautes e mutantes sensíveis a temperatura). Os resultados revelaram, respectivamente, 338 e 239 genes das coleções de linhagens nocautes e mutantes...