A substituição do meio TCM pelo meio BARC, suplementado com SFB, BSA ou PVA, para maturação de oócitos bovinos in vitro, não incrementa a subsequente produção de blastocistos

Abstract

This study was carried out to assess the influence of bovine embryo culture medium Beltsville Agriculture Research Center (BARC), supplemented with FCS, BSA or PVA, on the in vitro oocyte maturation, evidenced by cleavage rate and blastocysts production at different developmental stages. Three experiments were performed, as follows: exp.1: addition of FCS to BARC medium at concentrations of 0, 5 and 10%; exp. 2: addition of BSA to BARC medium at concentrations of 0, 4 and 8 mg/ml; exp. 3: addition of PVA to BARC medium at concentrations of 0, 0.5 and 1.0 mg/ml. TCM 199 supplemented with bicarbonate, pyruvate, gentamicin sulfate, FSH, LH and FCS was used as control group. Oocytes obtained from cow ovaries at slaughterhouse were selected in PBS, and then matured in BARC medium supplemented with FSH, LH and gentamicin sulfate, according to the experimental design. Percoll gradient was used for sperm selection and TALP medium for IVF. In vitro embryo culture was in SOF-m medium; a humidified atmosphere with 5% CO2, in air, at 38.7oC was used for all steps. The number of oocytes reaching blastocyst, expanded blastocyst, and hatched blastocyt stages was recorded, respectively at 72 and 168 h post-insemination. ANOVA and Bonferroni t test were used to determine differences among groups. Differences of P<0.05 were taken as significant. Higher percentage (P<0.05) of cleaved oocytes was observed in group TCM + FCS than for the other groups matured in BARC supplemented with FCS or BSA, regardless the concentration used. However, the cleavage rate was similar between groups BARC plus PVA with 1 mg/ml (85.7%) and TCM + FCS (90.8%). Significant difference was found among groups for the production of blastocysts, with the control group yielding a higher number of blastocysts (results ranging from 47.4 to 51.4%, in comparison with groups using BARC + FCS (4.1 to 19.7%), BSA (1.4 to 5.6%) and PVA (5.7 to 10.6%). In conclusion, BARC medium supplemented with different macromolecules did not promote a beneficial effect on in vitro oocyte maturation, resulting in lower rate of cleavage and blastocyst production when compared with TCM + FCS medium.

El presente trabajo tuvo como objetivo verificar la influencia del medio de cultivo de embriones bovinos "Beltsville Agriculture Research Center” (BARC), complementado con SFB, BSA o PVA, en la maduración in vitro de ovocitos, evidenciado a través de la tasa de fecundación y formación de blastocistos en diferentes etapas de desarrollo. Se realizaron tres experimentos, a saber: EXP 1: SFB añadido al medio BARC en concentraciones de 0, 5 y 10%; EXP 2: BSA añadido al medio BARC en concentraciones de 0, 4 y 8 mg/ml; EXP. 3: PVA se utilizó en el medio BARC en concentraciones de 0, 0.5 y 1 mg/ml. El medio de cultivo TCM 199 con piruvato, gentamicina, FSH, LH y SFB se utilizó como grupo control. Los ovocitos, obtenidos de ovarios de vacas enviadas al matadero, se seleccionaron en medio PBS y luego fueron madurados en medio BARC con FSH, LH, gentamicina y distintas macromoléculas. La selección del esperma se hizo con gradiente de Percoll, utilizando el medio TALP para la fecundación in vitro. Los embriones fueron cultivados en medio SOF modificado; ovocitos yembriones fueron incubados a 38,7°C, 5% de CO2 en aire y atmosfera húmeda. El número de ovocitos que fertilizaron y alcanzaron los estadios de blastocisto, blastocisto expandido y blastocisto eclosionado, respectivamente, se registraron 72 y 168 horas post inseminación. Análisis de varianza y la prueba t de Bonferroni se utilizaron para el análisis estadístico, con P<0.05. Porcentaje más alto (P<0.05) de ovocitos que clivaram fue observada en el grupo TCM + SFB que en los grupos madurados en medio BARC con SFB o BSA, independientemente de la concentración utilizada. Sin embargo, la tasa de fecundación fue similar entre grupos BARC + PVA con 1 mg/ml (85,7%) y TCM + SFB (90,8%). Diferencia significativa (P<0.05) se encontró entre los grupos para el desarrollo de blastocistos, con el grupo TCM + SFB produciendo un mayor número de blastocistos, en diferentes estadios (resultados que van desde 47,4 a 51,4%) en comparación con los grupos utilizando BARC + SFB (4,1 a 19,7%), BSA (1,4 a 5,6%) y PVA (5,7 a 10,6%). En conclusión, el medio BARC complementado con diferentes macromoléculas no fue eficiente en la promoción de una adecuada maduración de ovocitos bovinos in vitro, resultando en una tasa de fecundación y producción de blastocistos baja, en comparación con el medio TCM con SFB.

O presente trabalho teve como objetivo verificar a influência do meio de cultivo de embriões bovinos “Beltsville Agriculture Research Center” (BARC), suplementado com SFB, BSA e PVA, separadamente, sobre a maturação de oócitos in vitro, evidenciada pela taxa de clivagem e formação de blastocistos em diferentes estágios de desenvolvimento. Três experimentos foram efetuados, de acordo com o seguinte delineamento experimental: exp.1: SFB foi adicionado ao meio BARC nas concentrações de 0, 5 e 10%; exp. 2: BSA foi adicionada ao meio BARC nas concentrações de 0, 4 e 8 mg/mL; exp. 3: PVA foi adicionado ao meio BARC nas concentrações de 0, 0,5 e 1 mg/mL. O meio de cultura TCM 199, acrescido de bicarbonato, piruvato, gentamicina, FSH, LH e SFB, foi utilizado como grupo controle. Os oócitos, obtidos de ovários de vacas destinadas ao abate comercial, foram selecionados em meio PBS e, a seguir, maturados em meio BARC acrescido de FSH, LH, gentamicina e as respectivas macromoléculas. A seleção espermática foi realizada em gradiente de Percoll, utilizando o meio TALP para a FIV. O cultivo in vitro dos embriões foi em meio SOF modificado; todas as etapas foram realizadas em incubadora a 5% de CO2 em ar, a 38,7 ºC, atmosfera úmida. O número de oócitos que clivou e atingiu os estágios de blastocisto, blastocisto expandido e blastocisto eclodido foi registrado, respectivamente, as 72 e 168 horas pós-inseminação. ANOVA e teste t de Bonferroni foram empregados para a análise estatística, com P<0,05 sendo considerado significativo. Maior porcentagem (P<0,05) de oócitos que clivaram foi observada no grupo TCM + SFB do que nos grupos maturados em meio BARC com SFB ou BSA, independentemente da concentração adotada. Contudo, a taxa de fertilização foi similar entre os grupos BARC + PVA com 1 mg/mL (85,7%) e TCM + SFB (90,8%). Diferença significativa (P<0,05) foi constatada entre os grupos para o desenvolvimento de blastocistos, com o grupo TCM + SFB produzindo um maior número de blastocistos, em diferentes estágios (resultados variando de 47,4 a 51,4%) em comparação com os grupos utilizando BARC + SFB (4,1 a 19,7%), BSA (1,4 a 5,6%) e PVA (5,7 a 10,6%). Concluindo, o meio BARC suplementado com diferentes fontes de macromoléculas não foi eficiente em promover adequada maturação dos oócitos bovinos in vitro, resultando em uma baixa taxa de fertilização e de produção de blastocistos, em comparação com o meio TCM + SFB.