Produção, imobilização e aplicação de lipase de Fusarium verticillioides

Abstract

Este trabalho visou produzir e estudar a lipase do fungo Fusarium verticillioides. A enzima obtida foi avaliada quanto à capacidade de hidrolise, esterificação e transesterificação para a produção de ácidos graxos e ésteres. A cepa fúngica foi cultivada em diferentes meios de cultura, variando as fontes de nitrogênio e de carbono, avaliando-se as atividades. Verificou-se que o tipo de atividade e especificidade da lipase dependem dos nutrientes utilizados nos meios de cultivo do fungo por fermentação em estado sólido. A lipase foi caracterizada físicoquimicamente e apresentou temperatura ótima em 35°C e melhor estabilidade durante 5 horas em 30°C, entretanto a 35°C também foi observada uma boa estabilidade. O pH ótimo foi em 8, e melhor estabilidade em pH ácido (5 e 6). Esta última característica foi muito importante, já que a reação de transesterificação geralmente ocorre em pH 5. A enzima também se mostrou estável na presença de n-hexano e etanol e apresentou uma ativação durante 24 horas diante destes solventes orgânicos. Também foi observada a presença de mais de uma lipase na membrana celular da cepa, o que levou a avaliar sua ação na forma de células imobilizadas diretamente em farelo de trigo e na forma livre. A lipase imobilizada na biomassa fúngica também foi caracterizada, apresentando melhor atuação em pH 8, como ocorreu com a lipase extracelular, porém em 30°C. Por meio de planejamentos fatoriais foi possível observar que a lipase apresenta melhor atividade quando se utilizada ácidos graxos e álcoois de cadeias carbônicas maiores, além de atuar melhor em reações de transesterificação, utilizando-se óleo pré-usado. A célula imobilizada em farelo de trigo foi empregada em hidrólises, sendo obtido 34,9 % de ómega 3 a partir do óleo de canola e 70,9 % de ômega 6 a partir do óleo de linhaça em 12 horas de reação. O extrato bruto de enzimas extracelulares foi submetido à imobilização em suportes inertes. Em octil e fenil-sepharose foi possível imobilizar preferencialmente lipase, sendo verificado por meio da reação de hidrólise do butirato de p-nitrofenila e da quantificação de proteínas totais, com posterior dessorção com triton x 100. O suporte Lewatit 105 mostrou-se ideal para ser utilizado nas reações de esterificação e transesterificação, apresentando boa estabilidade na temperatura ótima da enzima (35°C) e em solução com até 50 % de etanol, também sendo ativado neste meio. Este suporte foi escolhido para aplicação na produção de ésteres etílicos. A enzima extracelular imobilizada e a célula inteira foram aplicadas em reações de esterificação e transesterificação resultando em rendimentos entre 5 e 12 % de ésteres etílicos.

This work aimed to produce and study the lipase from the Fusarium verticillioides fungus. The enzyme obtained was evaluated according to its capacity of hydrolysis, esterification and transesterification to the production of fatty acids and esters. The fungal strain was cultivated in different culture media, varying sources of nitrogen and carbon, evaluating the activities. It was found that the type of activity and the specificity of the lipase depend on the nutrients used in the fungus culture media by fermentation in solid state. The lipase was physically and chemically characterized and presented optimum temperature at 35°C and better stability during 5 hours at 30°C; however, at 35°C it was also observed good stability. The optimum pH was 8 and the stability was better at acid pHs (5 and 6). This last feature was very important, since the transesterification reaction usually happens at pH 5. The enzyme was also stable in the presence of n-hexane and ethanol and presented hyperactivation during 24 hours before these organic solvents. It was also observed the presence of more than one lipase on the cell membrane of the strain, which led to the evaluation of its action in the form of immobilized cells directly in wheat bran and in free form. The lipase immobilized in the fungal biomass was also described presenting better performance at pH 8, as it happened with the extracellular lipase, but at 30°C. Through factorial design, it was possible to observe that the lipase has better activity when fatty acids and alcohols from higher carbon chains are used, besides performing better in transesterification reactions using oils pre-used. The immobilized cell in wheat bran was used in hydrolysis, being 34.9 % of omega 3 obtained from canola oil and 70.9 % of omega 6 from linseed oil in 12 hours of reaction. The extracellular enzyme crude extract was submitted to immobilization in inert carriers. In octyl and phenyl-sepharose, it was possible to immobilize preferably lipase, being it verified through the p-nitrophenyl butyrate hydrolysis reaction and the quantification of total proteins, with subsequent desorption with triton x 100. The Lewatit 105 carrier proved ideal to be used in the esterification and transesterification reactions, presenting good stability at the enzyme optimum temperature (35°C) and in solution with up to 50 % of ethanol, also, being hyper-activated in this medium. This carrier was chosen to be used in the production of ethyl esters. The extracellular immobilized enzyme and the whole cell were used in esterification and transesterification reactions, resulting in returns between 5 and 12 % of ethyl esters.