Apoptose em placentônios bovinos de gestações de conceptos naturais e de transgênicos clonados

Abstract

A placenta dos mamíferos é um órgão transitório formado pela justaposição entre os tecidos maternos e fetais, sendo responsável pelas trocas fisiológicas entre a mãe e o feto e pela síntese de hormônios fundamentais para a manutenção da gestação. Para o crescimento placentário e a nutrição fetal é necessário um delicado equilíbrio entre proliferação e morte das células placentárias. Essas células possuem propriedades específicas em relação a suas funções metabólicas, endócrinas e angiogênicas sendo fundamentais para o desenvolvimento adequado do concepto ao longo da prenhez e seu nascimento. Gestações de animais clonados frequentemente apresentam anormalidades como hidroâmnio, hidroalantoide, edema placentário, retenção de placenta e abortos. Neste estudo, foi avaliada a ocorrência de apoptose (morte celular) em placentônios provenientes de conceptos bovinos transgênicos clonados (n=5) e de gestações naturais (n=18), nos períodos de 60 e 90 dias de gestação, que tiveram seu desenvolvimento interrompido para remoção do útero gestante. As amostras de placentônio foram segmentadas e fixadas em solução aquosa de paraformoldeído a 4% em tampão fosfato de sódio (PBS) a 0,1M e pH 7.4, para verificação da morfologia pela coloração HE e realização da técnica de imunoistoquímica. Os resultados obtidos foram comparados entre bovinos clonados transgênicos e de gestações naturais. Todos os grupos e idades gestacionais analisados apresentaram a mesma composição celular com epitélio uterino simples cúbico onde nota-se a presença de células trofoblásticas gigantes mononucleadas e células trofoblásticas gigantes binucleadas migradas do epitélio fetal, estroma endometrial bem desenvolvido, epitélio trofoblástico com células cuboides típicas de epitélio e quantidade acentuada de células trofoblásticas gigantes e gigantes binucleadas migrando para o epitélio materno e mesênquima. Em todos os grupos e períodos gestacionais, o epitélio materno apresentou maior marcação positiva para apoptose. Aos 60 dias a marcação positiva no epitélio uterino das gestações manipuladas foi menos evidente em relação às de gestações naturais, assim como aos 90 dias, que apresentou maior imunorreatividade em comparação aos 60 dias e dos animais de gestação natural sobre os manipulados. Na ultima idade gestacional foi possível observar reação em padrão de fileiras no epitélio uterino e para ambos os grupos não foram encontradas marcações nos tecidos fetais. Neste estudo foi demonstrado desequilíbrio nos padrões de apoptose nos conceptos bovinos clonados transgênicos, pois no início da gestação (60 dias) apresentaram menor atividade apoptóticas e aos 90 dias um aumento, podendo ser este fato um dos fatores que levam às anormalidades placentárias. Desse modo os resultados da verificação da apoptose, nas fases de gestação estudadas, e seu entendimento são importantes para a compreensão de possíveis falhas no desenvolvimento gestacional em técnicas avançadas de manipulação embrionárias, como a produção de animais transgênicos e clonados.

The placenta in mammals is a transitional organ formed by the justaposition between maternal and fetal tissues, it is responsible for physiological exchanges between mother and fetus and the synthesis of hormones essential for maintaining gestation. For the fetal placental growth and nutrition are requires a delicate balance between proliferation and death cells of the placenta. These cells have specific properties in relation to its metabolic functions, endocrine and angiogenic and it is critical to the proper development of the fetus throughout pregnancy and birth. Cloned animals often have abnormal pregnancies as hidroamnion, hidroalantois, placental edema, retained placenta and abortion. In this study, placentomes the occurrence of apoptosis (death cells) was avaluate from fetuses cloned transgenic cattle (n = 5) and natural pregnancies (n = 18) in periods of 60 and 90 days of gestation that had their intermited development to remove the pregnant uterus. Placentome samples were segmented and fixed in aqueous 4% paraformaldehyde in sodium phosphate buffer (PBS) pH 7.4 and 0.1M, to check the morphology of HE staining and the immunohistochemistry. The results were compared between transgenic cloned cattle and natural gestations. In all groups and gestational ages analyzed showed the same cellular composition with simple cubic uterine epithelium, it is noted the presence of trophoblast giant cells mononuclear and giant trophoblast cells binucleated migrated from fetal epithelium, endometrial stroma well developed, trophoblastic epithelium with typical cuboid cell epithelium and severe amount of giants and giant binucleated trophoblastic cells migrating into maternal epithelium and mesenchyme. All groups and gestational periods, maternal epithelium showed higher positive staining for apoptosis. At 60 days the positive staining in the uterine epithelium is less evident manipulated pregnancies in relation to natural pregnancies as well as at 90 days, with the highest immunoreactivity when it is compared to 60 days and in the animals of natural pregnancy in ratio to manipulated animals. In the last gestational age was observed in response pattern rows in the uterine epithelium and both groups fetal side tags were not found either in or on the epithelium and mesenchyme. This study demonstrated an imbalance in apoptosis patterns in transgenic cloned cattle fetuses as early in pregnancy (60 days) showed less apoptotic activity and an increase at 90 days and may be this fact one of the factors leading to placental abnormalities. Thereby the results of the verification of apoptosis at the stages of pregnancy studied and comprehension are important for the understanding of possible failure in gestational development in advanced embryonic manipulation techniques, such as the production of transgenic and cloned animals.