Avaliação da teneurina-2 (Ten-2) nos astrócitos do córtex cerebral de ratos adultos após lesão mecânica. Estudo imuno-histoquímico e de expressão gênica

Abstract

As teneurinas (TENs) pertencem a uma família de proteínas transmembrana do tipo II constituída por quatro membros homólogos, estruturalmente conservados entre as espécies. Essas proteínas estão presentes no SNC, principalmente durante a neurogênese, colaborando na estabilização dos circuitos neurais. Estudos neuroanatômicos mostraram que as TENs apresentam distribuição similar em peixes, aves e roedores durante o desenvolvimento e maturação do SNC, permanecendo em algumas regiões em animais adultos. A participação das TENs durante reparação tecidual tem sido pobremente explorada; entretanto a presença neurestina (uma proteína homóloga a Ten-2) foi notada em neurônios do bulbo olfatório de ratos adultos, após indução de lesão química na mucosa olfatória. O propósito do presente estudo foi verificar possíveis alterações na Ten-2 após indução de lesão mecânica no córtex cerebral de ratos adultos empregando técnicas de imuno-histoquímica (IHQ) e reação em cadeia da polimerase (PCR convencional). Para isso, ratos machos adultos (Rattus norvegicus, n=32) foram divididos em grupo controle (n=4, IHQ; n=4, PCR), grupo lesão 12 horas pós-operatório (n=4, IHQ; n=4, PCR), grupo lesão 24 horas (n=4, IHQ; n=4, PCR) e grupo lesão 48 horas (n=4, IHQ; n=4, PCR). A lesão mecânica foi realizada usando agulha hipodérmica de metal (0,8mm de diâmetro) acoplada ao aparelho estereotáxico (coordenadas AP: +10,21 mm; DV: -2,5 mm e ML: +1,5 mm). Os animais do grupo controle não foram submetidos aos processos cirúrgicos. Para as análises imuno-histoquímicas, os animais foram submetidos à perfusão transcardíaca usando paraformaldeído tamponado a 4% e os cortes histológicos foram obtidos utilizando micrótomo de congelação. Os cortes histológicos foram submetidos às técnicas de imunofluorescência ou imunoperoxidase indiretas usando anticorpos para identificar proteína ácida fibrilar glial (GFAP) e Ten-2, seguido por análises em microscopias de campo claro ou confocal. Para análises de expressão gênica, os animais foram sacrificados, o córtex cerebral foi imediatamente coletado para extração e purificação do RNA total. O RNA foi usado para amplificar a Ten-2 e o neurofilamento de cadeia leve (Nefl, para normalização) através de PCR convencional e as análises semi-quantitativas foram realizadas pela mensuração da densidade óptica das bandas em gel de agarose. Os principais resultados indicaram um aumento significante em astrócitos imunorreativos para a Ten-2 em todos os grupos lesões, especialmente no grupo lesão 48 horas (p<0,001), comparado com o grupo controle. As análises de expressão gênica mostraram aumento significante para a expressão de Ten-2, principalmente no grupo lesão 48 horas (p<0,01), comparado com os demais grupos com lesão. O presente estudo demonstrou pela primeira vez a presença de Ten-2 em astrócitos, após indução de lesão mecânica no córtex cerebral de ratos adultos. Estudos futuros são necessários para elucidar se a Ten-2 presente nos astrócitos exerce um papel facilitatório ou inibitório no reparo tecidual do SNC após lesões mecânicas.

Teneurins (TENs) constitute a type II transmembrane protein family with four homologues structurally preserved among the species. These proteins are present in the central nervous system (CNS), mainly during neurogenesis, collaborating in the establishment of neuronal circuits. Neuroanatomic studies showed that TENs have compatible distribution among fish, chicken and rodents, during development and maturation of the CNS, remaining in a few regions in adult animals. The participation of TENs during tissue repair in the CNS has been scarcely explored; however, the unusual presence of neurestin (a homologue Ten-2 protein) was noticed in neurons of adult rat olfactory bulb, after chemically induced lesion in the olfactory mucosa. The purpose of the present study was to verify possible Ten-2 alterations after induced mechanical lesion in the adult rat cerebral cortex using immunohistochemistry (IHQ) and conventional polymerase chain reaction (PCR) techniques. For this, adult male rats (Rattus norvegicus, n=32) were divided into control group (n=4, IHQ; n=4, PCR) and 12h lesion (n=4, IHQ; n=4, PCR), 24h lesion (n=4, IHQ; n=4, PCR) and 48h postoperatory lesion (n=4, IHQ; n=4, PCR) groups. The mechanical lesion was created using a hypodermic metal needle (0.8 mm of diameter) coupled with stereotaxic apparatus (coordinates: AP, +10.21 mm; DV, -2.5 mm; ML, +1.5 mm). Animals from control group were not submitted to surgical procedures. For IHQ analysis, animals were submitted to transcardiac perfusion using 4% buffered formaldehyde and 30 µm histological sections were obtained using a freezing microtome. Sections were submitted to indirect immunofluorescence or immunoperoxidase methods using antibodies to identify glial fibrillary acidic protein (GFAP) and Ten-2-like immunoreactivity, followed by confocal or light microscope analysis. For genic expression analysis, the animals were sacrificed and the cerebral cortex was immediately collected for total RNA extraction and purification. The RNA was used to amplify Ten-2 and light chain neurofilament (for normalization) by conventional PCR and semi-quantitative analysis was made from agarosis gel analysis bands. The main results indicated a significant increase in astrocyte cell profiles immunoreactive to Ten-2 in all lesion groups, especially in the 48h lesion group (p<0.001), compared with the control group. The genic expression analysis showed significant increase of Ten-2 expression mainly in the 48h lesion group (p<0.01) compared with the other lesion groups. The present study showed for the first time the presence of Ten-2 in astrocytes after mechanically induced lesion in the cerebral cortex of adult rats. Further studies are necessary to elucidate whether Ten-2 in astrocytes exerts a facilitatory or inhibitory role in CNS tissue repair after mechanical brain lesions.