Estudos computacionais de esfingomielinases D: docking, dinâmica molecular e métodos híbridos QM/MM

Abstract

Sphingomyelinases D (SMase D) are enzymes that catalyze sphingomyelin in ceramida-1-fosfate and choline. This activity is only found in Loxosceles brown spiders and Corynebacterium pathogenic bacterias. SMase D, or phospholipase D, is the main component of spider venoms of the genus Loxosceles, being able to induce the characteristic dermonecrotic features of the whole venom. Despite of the clinical importance o these enzymes, their action mechanism is not completely described. In this work, the catalytic mechanism of SMases D against sphingomyelin is studied through computational methods like docking, classical molecular dynamics, constant pH simulations and hybrid methods QM/MM. First, molecular interactions of SMases D with sulfate ion, myo-inositol-1-phosphate, sphingomyelin (the substrate) and suramin inhibitor are evaluated, as well as the protonation states of the catalytic histidines, 12 and 47, in presence or absence of ligands in the active site. Then, the free energy barrier of 21 kcal/mol for choline release is estimated using the transition state theory and the catalytic constant of Loxosceles laeta activity (kcat). This value is compared to the activation energies obtained through QM/MM simulations for covalent (between 18 and 24 kcal/mol) and non-covalent (25 kcal/mol) pathways. Additionally, the hydroxyl group of sphingomyelin is proposed to play a crucial role in the catalytic mechanism. Depending on the binding way of the hydroxyl group, the catalysis may be covalent or non-covalent, with different reaction products in each case. Interestingly, the two processes showed similar activation energies, suggesting that they may be equally probable, as discussed in some experimental studies for different phospholipase D. Finally, the affinity of SMases for mimetic membranes is discussed

Esfingomielinase D (SMase D) é uma enzima conhecida por catalisar a clivagem de esfingomielina em ceramida-1-fosfato e colina, atividade presente apenas em aranhas do gênero Loxosceles (aranhas marrom) e em bactérias patogênicas do tipo Corynebacterium. A SMase D, também encontrada na literatura como fosfolipase D, é o principal componente do veneno de aranhas do gênero Loxosceles, capaz de induzir sozinha as lesões dermonecróticas características do loxoscelismo. Apesar da importância clínica, poucos detalhes sobre o mecanismo de ação destas enzimas são conhecidos. Neste trabalho, o mecanismo catalítico das SMases D de aranhas do gênero Loxosceles é estudado através de métodos computacionais como docking, dinâmica molecular clássica, simulações a pH constante e métodos híbridos QM/MM. Primeiramente são avaliadas as interações da SMase D com o íon sulfato, mio-inositol-1-fosfato, o substrato esfingomielina e o inibidor suramina, assim como os prováveis estados de protonação das histidinas 12 e 47 na presença e ausência de ligantes. A seguir, a barreira de energia livre experimental para liberação da colina é estimada em 21 kcal/mol através da teoria do estado de transição e da constante catalítica (kcat) da SMase D de Loxosceles laeta. Este valor é comparado às energias de ativação calculadas em simulações QM/MM para as vias de catálise covalente (entre 18 e 24 kcal/mol) e não covalente (25 kcal/mol), os quais correlacionam bem com o valor de 21 Kcal/mol, estimado experimentalmente. Adicionalmente, é sugerido um papel crucial para o grupo hidroxila da esfingomielina no processo de catálise. Dependendo do modo de ligação da hidroxila, a catálise pode ser covalente ou não covalente, com produtos distintos nos dois tipos de catálise. Interessante notar que os dois processos possuem energias de ativação comparáveis, em torno de 25 Kcal/mol, o que poderia supor que os dois processos são...