Pontos Quânticos à base de óxido de zinco (ZnO) para aplicações em bioimagem de nanocarreadores lipídicos

Abstract

Sistemas teranósticos consistem em um único dispositivo contendo agentes terapêuticos e de diagnóstico e tem ganhado atenção nas pesquisas atuais por melhorar o tratamento de doenças como câncer, podendo diminuir efeitos colaterais, diminuir toxicidade em células não cancerígenas e permitir o monitoramento do tratamento. Os pontos quânticos (PQs) vem sendo usado como agentes de imagem para realizar o monitoramento ótico em investigações in vivo e in vitro. Dentre eles, o ZnO tem se destacado por ser mais barato, mais biocompatível e menos tóxico do que os utilizados comumente (SeCd, PbS, etc). O objetivo deste trabalho foi desenvolver sistemas teranósticos constituídos de nanocarreadores à base de lipídeos contendo pontos quânticos a base de ZnO, como guias luminescentes de células cancerígenas, e um fármaco modelo para tratamento do câncer. Primeiramente, foi estudada a síntese de pontos quânticos de ZnO/ZnS (estrutura de casca/caroço) pelo processo sol-gel, a fim de melhorar as propriedades luminescentes do ZnO através da passivação da sua superfície provocada pelo ZnS. Para isto, as reações de síntese tiveram como base (i) a solução precursora de acetato de Zinco e (ii) a suspensão coloidal de ZnO. Além disso, foram variadas as concentrações de tioacetamida (TAA) (1.5, 5 e 50mM), usada como fonte de íons de enxofre. Para diferenciar a formação de estruturas casca/caroço (ZnO/ZnS) e não uma mistura de partículas de ZnO e ZnS, várias técnicas foram utilizadas para caracterizar as amostras (DRX, XAS, SAXS, UV-vis, pH, HRTEM e PL). Dentre elas, XAS foi crucial para identificar que somente a reação realizada a partir da suspensão coloidal de ZnO com TAA 5mM deu origem à estrutura de ZnO/ZnS do tipo casca/caroço. Entretanto, os PQs de ZnO/ZnS não apresentaram maior intensidade da emissão na região do visível quando comparado ao ZnO. Portanto, PQs de ZnO foram dopados com Mg para gerar elétrons ou buracos extras na sua estrutura levando a mudanças em suas propriedades luminescentes. Diferentes quantidades de Mg (2.5, 5, 10 e 20 % em mol) foram usadas durante a síntese de ZnO pelo processo sol-gel para poder obter, assim, partículas com maior luminescência na região do visível. DRX, HRTEM, ICP-MS, SAXS, UV-Vis e PL foram usadas a fim de avaliar as características físico-químicas dos diferentes Zn1-xMgxO obtidos. Observou-se a diminuição do tamanho das partículas com o aumento da concentração de Mg. Quando se utilizou 20 % em mols em concentração nominal de íons Mg2+ no meio reacional (Zn0.8Mg0.2O), o rendimento quântico (RQ) foi seis vezes maior (RQ = 64%) do que a suspensão de ZnO não dopado (RQ = 10%). Para utilizar os PQs em meio biológico mantendo sua propriedade fotoluminescente, sua superfície normalmente é modificada com substâncias hidrofílicas para torná-los estáveis em água, ou com substâncias hidrofóbicas para permitir sua incorporação em sistemas/carreadores à base de lipídeos ou polímeros. Os PQs de ZnO e de Zn0.8Mg0.2O foram revestidos com ácido oleico (AO) formando uma dispersão coloidal estável em clorofórmio e tolueno. A espectroscopia RAMAN permitiu confirmar a modificação da superfície dos PQs pela presença dos grupamentos característicos do AO nessas amostras. O RQ do Zn0.8Mg0.2O revestido com AO foi em torno de 4 vezes maior (RQ = 40%) que o RQ de ZnO revestido com AO. Por fim, os PQs de Zn0.8Mg0.2O revestidos e não-revestidos com AO foram incorporados em nanocarreadores lipídicos para serem utilizados posteriormente nos estudos de internalização celular. Formulações à base de DPPC, DSPE-Peg e nanopartículas lipídicas sólidas (NLS) contendo PQs foram obtidos com diâmetro hidrodinâmico entre 100-220 nm. A formulação preparada com DSPE-Peg apresentou maior intensidade de emissão no visível quando comparadas com as NLS. O estudo de estabilidade realizado com as NLS luminescentes em diferentes meios (água, PBS, PBS com Mg e Ca, RPMI com soro à 10%) à 37°C durante 3 horas, mostrou que o tamanho delas não variou bruscamente no tempo analisado. Nesse estudo o tamanho máximo encontrado foi de 300 nm, mostrando que na presença de proteínas, elas não formam grandes agregados que podem favorecer a fagocitose pelo sistema mononuclear. Foram utilizados três métodos para realizar o estudo de internalização celular. O estudo da associação de fluorescência mostrou aumento da intensidade de emissão no visível de células de macrófagos J774 tratadas com 2 mg/mL de NLS luminescente durante 50 min, comparado com as células sem tratamento. Este resultado sugere internalização parcial das NLS nos macrófagos. A vídeo-microscopia e a microscopia de fluorescência não tiveram sucesso para realizar este estudo, uma vez que as condições experimentais utilizadas não puderam superar o efeito de auto-fluorescência das células. Para concluir, a síntese de PQs à base de ZnO pelo processo sol-gel possibilitou estudar as estruturas e propriedades luminescentes destes, permitindo otimizar sua síntese para adequá-los para uso como guias luminescentes. Desta forma, Zn0.8Mg0.2O com alto rendimento quântico foi incorporado em nanocarreadores lipídicos e sua aplicação como guia luminescente foi evidenciada através do teste de associação de fluorescência.

Les systèmes théranostiques sont constitués d’un dispositif unique contenant des agents thérapeutiques et diagnostiques et attirent actuellement l'attention pour améliorer le traitement de maladies telles que le cancer ; ils pourraient réduire les effets secondaires (e.g. la toxicité pour les cellules non-cancéreuses) et permettre le suivi du traitement. Les quantum dots (QDs) sont utilisés comme agents d'imagerie in vitro et in vivo. Parmi ceux-ci, ZnO est moins cher, plus biocompatible et moins toxique que ceux utilisés couramment (SeCd, PbS, etc.). Le but de notre étude était de développer des systèmes théranostiques constitués de nanoparticules lipidiques contenant des QDs à base de ZnO comme agent luminescent, l’objectif final étant d’incorporer un principe actif pour le traitement du cancer. Nous avons d’abord étudié la synthèse de QDs de ZnO/ZnS (structure coeur/coquille) par le procédé sol-gel, afin d'améliorer les propriétés de luminescence de ZnO grâce à la passivation de la surface par le ZnS. Pour cela, deux voies de synthèse ont été explorées: le thioacétamide (TAA), utilisé comme source d'ions soufre, a été ajouté à (i) la solution de précurseur de l'acétate de zinc, et (ii) la suspension colloïdale de ZnO. Différentes concentrations de thioacétamide (TAA) ont été utilisées (1,5, 5 et 50 mM). Pour distinguer la formation de la structure coeur/coquille (ZnO / ZnS) d’un simple melange de particules de ZnO et ZnS, les échantillons ont été caractérisés par plusieurs techniques (DRX, XAS, SAXS, UV-vis, pH, HRTEM et PL). Parmi celles-ci, l’absorption des rayons X (XAS) a été essentielle pour montrer que seule la réaction effectuée à partir de la suspension colloïdale de ZnO contenant 5 mm de TAA donnait lieu à la structure ZnO/ZnS. Cependant, les QDs de ZnO/ZnS n'ont pas montré une intensité de l'émission dans le visible plus grande que celle des QDs de ZnO. Les QDs de ZnO ont donc été dopés pour générer des électrons ou des trous supplémentaires dans leur structure, entraînant des changements de leurs propriétés de luminescence. Différentes quantités de Mg (2,5, 5, 10 et 20% en mole) ont été ajoutées lors de la synthèse du ZnO par la voie sol-gel, afin d'obtenir des particules ayant une luminescence plus forte dans le visible. Plusieurs techniques (XRD, HRTEM, ICP-MS, SAXS, UV-Vis et PL) ont été utilisées pour déterminer les caractéristiques physico-chimiques des différents Zn1-xMgxO QDs obtenus. Il a été observé une diminution de la taille des particules avec l'augmentation de la concentration de Mg. Lors de l'ajout d’une concentration nominale de Mg2+ dans le milieu réactionnel de 20% molaire (Zn0.8Mg0.2O), le rendement quantique (QY) était six fois plus élevé (QY= 64%) que celui de la suspension de ZnO non dopé (QY= 10%). Pour utiliser les QDs dans un environnement biologique tout en conservant leurs propriétés de photoluminescence, leur surface est généralement modifiée par des substances hydrophiles pour les rendre stables dans l'eau, ou des substances hydrophobes pour permettre leur intégration dans des systèmes/nanoparticules à base de lipides ou de polymères. La surface des QDs de ZnO et Zn0.8Mg0.2O a été recouverte par de l'acide oléique (AO) ; les QDs ainsi modifiés forment une dispersion colloïdale stable dans le chloroforme et le toluène. La spectroscopie Raman a confirmé la présence d’acide oleique à la surface des QDs. Le rendement quantique des QDs de Zn0.8Mg0.2O recouverts d'AO était environ 4 fois plus élevé (QR = 40%) que celui des QDs de ZnO recouverts d’AO. Enfin, les QDs de Zn0.8Mg0.2O, recouverts ou non d’AO, ont été incorporés dans des nanoparticules lipidiques pour une utilisation ultérieure dans des études d'internalisation cellulaire. Des formulation à base de DPPC, DSPE-Peg et des nanoparticules lipidiques solides (SLN) contenant des QDs ont été préparées avec une taille hydrodynamique variant entre 100 et 220 nm. Les formulations à base de DSPE-Peg ont montré une intensité d'émission plus élevée dans le visible, comparé aux SLNs. L'étude de stabilité réalisée avec des SLNs luminescentes dans différents milieux (eau, PBS, PBS avec du Mg et du Ca, RPMI avec du sérum à 10%) à 37°C pendant 3 heures a montré que la taille ne changeait pas fortement au cours du temps. Dans cette étude, la taille maximale était de l’ordre de 300 nm, montrant que même en présence de protéines, il ne se forme pas de gros agrégats. Trois méthodes ont été utilisées pour l'étude de l'internalisation cellulaire dans des macrophages J774. Lorsque la longueur d’onde d’excitation correspond à celle des QDs, les mesures d’intensité de fluorescence sur les suspensions de cellules ont montré une faible augmentation de l’intensité de l’émission visible pour les cellules incubées avec 2 mg/mL de SLNs luminescentes pendant 50 minutes, en comparaison avec les cellules témoins. Ce résultat suggère une internalisation partielle des SLNs dans les macrophages. Malheureusement, ces résultats n’ont pas pu être confirmés par vidéo-microscopie et microscopie de fluorescence sur les cellules parce que les conditions expérimentales ( longueurs d’onde d’excitation et d’émission possibles) ne permettaient pas d’observer un signal supérieur à celui de l'auto-fluorescence des cellules. En conclusion, cette étude a permis d’optimiser la composition et la synthèse par voie sol-gel de QDs à base de ZnO pour les rendre aptes à être utilisés comme sondes luminescentes dans des nanoparticules lipidiques. La relation entre leur structure et leurs propriétés de luminescence a été étudiée; les QDs dopés Zn0.8Mg0.2O, qui ont le rendement quantique le plus élevé, ont pu être incorporés dans des nanoparticules lipidiques pouvant contenir des agents thérapeutiques.

Theranostic systems consist of a single device containing therapeutics and diagnosis agents and have increased attention in the actual researches because these devices can improve the disease therapy such as cancer, decrease the side effects and the toxicity in no-cancer cells and permit monitoring the treatment. The aim of this work was to develop theranostic systems consisted of lipid based nanocarriers containing ZnO based quantum dots (QDs) as cancer cell luminescent guides, and a model drug for cancer therapy. Firstly, it was study the synthesis of ZnO/ZnS QDs aiming to achieve improved luminescent properties. In this step, X-Rays Absorption Spectroscopy, together with other usual characterization techniques, could identify the synthesis condition in which core-shell structures were formed. Nevertheless, the emission of ZnO/ZnS QDs in the visible range was not promising. Therefore, Mg-doped ZnO QDs were synthesized and their luminescence went through a maximum for a 20 mol% nominal concentration of Mg2+ ions in the reaction medium. Zn0.8Mg0.2O QDs presented quantum yield (QY) six times higher (QY = 64%) than undoped ones (QY = 10%). ZnO and Zn0.8Mg0.2O QDs capped by oleic acid (OA) were synthesized and formed stable colloidal dispersions in chloroform and toluene. The QY of OA-Zn0.8Mg0.2O was about 4 times (around 40%) higher than that of the OA-ZnO QDs. Zn0.8Mg0.2O QDs and OA-Zn0.8Mg0.2O QDs could be incorporated into lipid based nanocarriers of average hydrodynamic diameter around 100 – 220 nm. The luminescent solid lipid nanoparticles (SLN) were stable in different media at 37°C during 3 hours. The fluorescence association study showed enhanced emission of the J774 macrophage-like cells treated with 2 mg/mL of luminescent SLN during 50 min, suggesting partial internalization of the nanoparticles into the macrophages. The internalization study using the video-microscope and fluorescence microscope were not successfully, once the equipment condition used could not overcome the cells auto-fluorescence phenomena.