Transcriptoma do fungo de origem marinha Peniophora sp. CBMAI 1063: análise dos genes de lacase, clonagem e expressão heteróloga

Abstract

As lacases pertencem ao grupo das multicobre oxidases e o interesse biotecnológico por essas enzimas se deve ao fato delas catalisarem reações envolvendo diferentes compostos fenólicos e amínicos. A utilização diversificada dessas enzimas na indústria estimula a busca por lacases capazes de se adaptar aos diferentes processos industriais visando encontrar a relação de ótimo custo-benefício. O basidiomiceto de origem marinha Peniophora sp. CBMAI 1063, já demonstrou capacidade de secretar quantidades significativas de lacase sob condições otimizadas (salinas) para produção da enzima. As lacases desse organismo podem apresentar características diferenciadas devido a origem marinha do basidiomiceto. Nesse sentido, o presente trabalho teve como objetivo a obtenção das sequências de lacase do fungo Peniophora sp. CBMAI 1063 através da análise do transcriptoma, afim de realizar a caracterização in silico dessas sequências, análises filogenéticas, clonagem e expressão heteróloga. Foram obtidas 13 isoformas de lacase correspondente a 8 genes putativos para a enzima, das 13 isoformas, 11 foram referentes a lacases extracelulares e 2 intracelulares. Todas as isoformas apresentaram-se ricas em conteúdo GC (> 52 %) sendo os aminoácidos Valina, Leucina, Serina, Ácido aspártico e Treonina os mais representativos na composição polipeptídica. A massa das lacases variou entre 53,5 e 64,6 kDa. Nove isoformas apresentaram o aminoácido Leucina e 4 isoformas apresentaram o aminoácido Fenilalanina na posição variável ligado ao cobre tipo 1 que possui atividade regulatória sobre a enzima. Nenhuma das isoformas apresentou similaridade maior a 57% em relação à outras sequências de lacases depositadas no NCBI e, portanto, demonstraram ser potencialmente diferentes das lacases originárias de outros basidiomicetos marinhos e terrestres. A clonagem de um fragmento codificante de lacase do fungo Peniophora sp. CBMAI 1063 possibilitou a montagem de sistemas de expressão baseado em 3 linhagens diferentes de Escherichia coli. Os resultados de expressão da enzima recombinante não foram conclusivos, contudo, o presente trabalho traz contribuições significativas ao estudo das lacases produzidas pelo fungo basidiomiceto de origem marinha Peniophora sp. CBMAI 1063, demonstrando a capacidade desse organismo de produzir diferentes lacases com potencial para aplicação biotecnológica.

Laccases belong to the group of multicobre oxidases and the biotechnological interest in these enzymes is due to the fact that they catalyze reactions involving different phenolic and amine compounds. The diverse use of these enzymes in the industry stimulates the search for laccases able to adapt to different industrial processes seeking to find the optimum cost-benefit ratio. The marine-derived basidiomycete Peniophora sp. CBMAI 1063, has demonstrated ability to secrete significant amounts of laccase under optimized conditions (salt) for the enzyme production. Laccases from this organism could present different characteristics due to its marine origin. The present study aimed to obtain the laccase sequences from the fungus Peniophora sp. CBMAI 1063 by transcriptome analysis in order to perform characterization of these sequences in silico, phylogenetic analysis, cloning and heterologous expression. A total of 13 laccase isoforms were obtained corresponding to eight putative genes for the enzyme. Among the 13 isoforms, eleven were related to extracellular laccases and two to intracellular. All isoforms showed abundance in GC content (> 52 %) with the amino acid Valine, Leucine, Serine, Threonine Aspartic Acid as the most representative in the polypeptide composition. The mass of laccases varied between 53.5 and 64.6 kDa. Nine isoforms showed the amino acid Leucine and four isoforms showed the amino acid Phenylalanine in the variable position on the copper type 1 which has regulatory activity on the enzyme. None of the isoforms showed a similarity over to 57% compared to other laccases sequences deposited in the NCBI and therefore shown to be potentially different from laccases from other marine and terrestrial basidiomycetes. The cloning of a DNA fragment that encodes laccase from Peniophora sp. 1063 CBMAI allowed the assembly of expression systems based on three different strains of Escherichia coli. The results of recombinant enzyme expression were inconclusive. However, this study brings significant contributions to the study of laccases produced by the marine-derived basidiomycete Peniophora sp. CBMAI 1063, demonstrating the ability of this organism to produce different laccases with potential for biotechnological application.