Padronização da metodologia de pcr em tempo real para avaliação da expressão gênica da proteína dash de Histoplasma capsulatum

Abstract

A histoplasmose é uma micose sistêmica, com características de doença granulomatosa com predileção pelo pulmão e órgãos do sistema imunológico e é causada pelo fungo Histoplasma capsulatum. Uma extensa diversidade de fungos patogênicos tem demonstrado a habilidade em colonizar superfícies e formar biofilmes, sendo a maior causa para resistência de infecções humanas. Existem diferentes perfis de expressão de proteínas por H. capsulatum quando comparado seu crescimento em culturas planctônicas e biofilmes. Desta forma, dando continuidade aos trabalhos realizados, nosso grupo propõe realizar a análise quantitativa da expressão do gene codificante da proteína DASH diferencialmente expressa por H. capsultaum durante a formação de biofilmes, a fim de selecionar alvos e/ou biomarcadores da interação fungo-células hospedeiras. Para a realização do estudo foi selecionada a cepa EH-315 de H. capsulatum. Após a formação dos biofilmes, as amostras de RNA foram obtidas por meio de extração com o reagente Trizol e com o kit da Qiagen RNeasy Plant Mini Kit®. Após a síntese e quantificação de cDNA, foi realizada a PCR em Tempo Real, sendo selecionado o gene codificante da proteína DASH para ter sua expressão avaliada nas diferentes condições de crescimento de H. capsulatum, em biofilmes e culturas planctônicas. Os resultados obtidos após quantificação do RNA extraído de cultura planctônica e biofilme da cepa EH-315 de H. capsulatum mostram que não foi obtida uma grande quantidade de produto e que sua pureza, se mostra comprometida. Apesar dos resultados do nosso estudo não permitirem a continuidade do processo de análise de expressão gênica, ele ainda assim teve relevância ao pontuar possíveis falhas no processo de extração de RNA.