Estudo da atividade anti-Paracoccidioides do composto galato de decila: mecanismo de ação e interação fungo-hospedeiro

Abstract

O fungo do gênero Paracoccidioides é o agente etiológico da paracoccidioidomicose (PCM), micose de grande importância no Brasil e América Latina. Há diferentes terapias disponíveis, como os antifúngicos da classe dos poliênicos, azóis e sulfonamidas. O desenvolvimento de novos antifúngicos com eficácia superior é necessário para prevenir recaídas e diminuir os efeitos secundários, o período de tratamento e sequelas. A molécula de ácido gálico com diferentes modificações (galatos de alquila) apresentou atividade antifúngica contra um painel representativo de fungos patogênicos. O galato de decila (G14) foi objeto de estudo deste trabalho, para o qual a interação Paracoccidioides¬-hospedeiro foi relacionada ao mecanismo de ação. Para tanto, o fungo Paracoccidioides lutzii (Pl01) foi desafiado com o G14 para análise das alterações no desenvolvimento de brotamentos e na viabilidade celular pelo ensaio de MTT. Foi avaliada a influência do G14 na taxa de interação de Pl01 com a linhagem de macrófago alveolar murino AMJ2-C11, com as linhagens pulmonares de mamífero A549 e MRC-5, e hemócitos da larva de Galleria mellonella utilizando ensaios por citometria de fluxo. O G14 ainda foi avaliado quanto à taxa de sobrevivência da larva de G. mellonella infectada e a capacidade na modulação da produção de óxido nítrico em macrófago RAW. O estudo do mecanismo de ação foi realizado pelo ensaio de interação químico-genética seguida da interação genética, que consiste na comparação de uma coleção de mutantes da levedura Saccharomyces cereviseae com perfil hipersensível ao G14, a um banco de dados de duplos mutantes para predizer a via afetada. Em P. lutzii (Pl01) e P. brasiliensis (Pb18) foi avaliada a taxa de atividade de enzimas n-glicosiladas (α-(1,3)-glucanase, N-Acetyl-β-D-glucosaminidase e α-amilase) ligadas à formação da parede celular; assim como a expressão relativa dos genes envolvidos através de PCR em tempo real. No ensaio de interação químico-genética, cerca de 50 mutantes foram hipersensíveis e com a análise da interação genética deduziu-se influência sobre a via de glicosilação e/ou na resposta a proteínas não enoveladas. A concentração de 0,5 µg/mL de G14 apresentou redução significativa de 42 % da atividade metabólica e de 38,5 % na formação de novos brotos do Pl01 com 24 horas de contato, indicando forte influência sobre o desenvolvimento da célula fúngica. As enzimas n-glicosiladas testadas para Pl01 e Pb18 apresentaram baixa atividade quando desafiadas com G14, porém os genes referentes a estas enzimas não apresentaram expressão relativa baixa, inferindo a influência nas modificações pós-traducionais destas enzimas. A influência do G14 na atividade funcional destas enzimas resulta na instabilidade da parede celular, a qual é um elemento crucial para a virulência e para a interação Paracoccidioides-célula hospedeira. Assim, foi observada redução na taxa de interação do Pl01 de 1,6 vezes com a linhagem A549, e de 1,2 com a linhagem AMJ2-C11. Além disso, foi observado um aumento no tempo de sobrevivência da larva infectada com Pl01 e tratada, indicando que G14 tem propriedades benéficas ao hospedeiro, o que foi observado com a redução de 20 % na quantificação de óxido nítrico quando macrófagos RAW estimulados por LPS foram desafiados com G14, o que sugere uma atividade antioxidante.

The fungus of genus Paracoccidioides is the etiological agent of paracoccidioidomycosis (PCM), an important mycosis in Brazil and Latin America. There are different available therapies, as antifungals belong to the class of polyenes, azoles and sulfonamides. The development of new antifungal agents with greater effectiveness is required to prevent relapse and reduce side effects, the period of treatment and sequelae. The gallic acid molecule with different modifications (alkyl gallates) showed antifungal activity against a representative panel of pathogenic fungi. The decyl gallate (G14) was the study object of this work, for which the Paracoccidioides-host interaction was connected with the mechanism of action. Therefore, the fungus Paracoccidioides lutzii (Pl01) was challenged with the G14 to analyze the changes in the development of budding and cell viability by MTT assay. Then, it was assessed the influence of the G14 in the interaction rate of Pl01 with murine alveolar macrophage lineage AMJ2-C11, with mammalian lung lineage A549 and MRC-5, and hemocytes of Galleria mellonella larvae using assays by flow cytometry. The compound G14 was evaluated for survival rate of infected G. mellonella larvae and to capacity of modulation of nitric oxide production in RAW macrophages. The mechanism of action was performed by chemical-genetic interaction assay followed by genetic interaction, which involves comparing a mutant collection, of Saccharomyces cerevisiae yeast, with hypersensitive profile to G14 to double mutant database to predict via affected. In P. lutzii (Pl01) and P. brasiliensis (Pb18) was evaluated the rate of activity of n-glycosylated enzymes (α- (1,3) -glucanase, N-Acetyl-β-D-glucosaminidase and α-amylase) linked to cell wall formation; as well as the relative expression of the genes involved by real time PCR. In the test chemical-genetic interaction, about 50 mutants were hypersensitive to G14 and with the genetic interaction analysis was deduced that it influence the glycosylation pathway and/or in the response unfolded proteins. The concentration of 0.5 µg/ml of G14 after 24 hours of contact showed a significant reduction of 42% in metabolic activity and 38.5% in the formation of new buds of Pl01, indicating a strong influence on the development of the fungal cell. The N-glycosylated enzymes tested for Pl01 and Pb18 after 72 hours of contact with 0.5 µg/ml of G14 showed low activity when challenged with G14, but the genes related to these enzymes did not show low relative expression, inferring the influence on the post-translational modification of these enzymes. The influence of the G14 in the functional activity of these enzymes results in the instability of the cell wall, which is crucial to the virulence and the host Paracoccidioides-cell interaction. Thus, it was observed a reduction in the interaction rate of Pl01 in 1.6 times with lineage A549 and in 1.2 times with lineage AMJ2-C11. Besides that, it was observed an increase of survival time of Pl01infected larvae and treated, indicating G14 has properties that benefit the host, what was observed with a reduction of 20% in the quantification of nitric oxide when RAW macrophages stimulated by LPS were challenged with G14, which showed an antioxidant activity.