Rastreabilidade de células germinativas primordiais (CGPs) e micromanipulação em duas espécies de peixes teleósteos

Abstract

O transplante de células germinativas primordiais (CGPs) é uma abordagem promissora para área da Aquicultura, mas para isso é necessária à compreensão dos estágios de desenvolvimento embrionário e larval como também a padronização de técnicas relacionadas à micromanipulação do embrião e de células germinativas a fim de obter com sucesso quimeras germinativas. Assim, os objetivos desta pesquisa foram avaliar o efeito de três temperaturas (22ºC, 26ºC e 30ºC) sob o desenvolvimento inicial de B. amazonicus (espécie doadora); desenvolver protocolos para micromanipulação de ovos, de células embrionárias e de criopreservação de blastômeros em Astyanax altiparanae (espécie receptora); identificar as CGPs e a rota de migração dessas células em ambas as espécies, além da produção de quimeras germinativas através do transplante de células embrionárias a fim de que a espécie receptora estéril (3n) produza gametas da espécie doadora. Para isso, os reprodutores das espécies envolvidas foram induzidos hormonalmente à reprodução, os gametas foram extrusados e fertilizados pelo método a seco. Para avaliar o desenvolvimento inicial, ovos recém-fertilizados foram distribuídos em aquários com oxigenação e temperatura controlada, coletados em momentos pré-estabelecidos e analisados sob estereomicroscópio. Para o desenvolvimento do protocolo de micromanipulação de ovos de Astyanax altiparanae, inicialmente avaliou-se a eficácia na remoção do córion em alíquotas de ovos recém-fertilizados distribuídas em placas de Petri contendo pronase (0,05%) ou tripsina (0,15%) diluídas em solução salina (Holtfreter; Characin; Ringer; Hanks; D-PBS ou MEM) e foi observada a solução enzimática mais eficiente sem afetar a viabilidade do embrião. Posteriormente, os ovos foram submersos nas mesmas soluções salinas testadas para remoção do córion, livres de enzimas. Para determinar a melhor solução salina de incubação foi observada a morfologia desses ovos. Ovos decorionados de A. altiparanae foram microinjetados com isotiocianato de fluoresceína (FITC-coloração verde) durante as primeiras clivagens e na fase de blástula, os blastômeros foram dissociados e imersos em soluções crioprotetoras com diferentes osmolaridade e concentrações para vitrificação. Após o descongelamento, a viabilidade foi analisada com auxilio de iodeto de propídio (cora em vermelho as células mortas). Para visualização e rastreabilidade das CGPs endógenas, ovos decorionados de A. altiparanae e B. amazonicus foram microinjetados com GFP-nos1 3’UTR mRNA no estágio de 1-2 células e mantidos em solução de Holtfreter e Characin, respectivamente e observados em cada estágio do desenvolvimento. Para o transplante, ovos da espécie doadora foram microinjetados com FITC no blastodisco para marcação celular, os ovos da espécie receptora foram submetidos a choque térmico para triploidização (3n). Quando as duas espécies atingiram o estágio de blástula, os blastômeros corados (doador) foram transplantados na blastoderme de embriões receptores não corados. A taxa de peixes quiméricos e a migração dos blastômeros do doador no embrião receptor foram mensuradas. Os resultados mostraram que a duração dos estágios de desenvolvimento foi maior em 22ºC e menor em 30ºC, e a fase de 512-1000 blastômeros, no estágio de blástula, fase de interesse para o transplante celular, foi de 1 h 30 min a 22ºC e limitada a 25 min nas demais temperaturas, afetando também o tempo de eclosão. A solução mais eficiente para remoção do córion em A. altiparanae foi de Characin com pronase (1:44 min) e para incubação dos ovos foi a solução de Holtfreter por apresentar blastômeros com tamanhos semelhantes, formando uma massa uniforme similar aos do controle. Após a criopreservação, 10% de blastômeros viáveis foram obtidos em quatro soluções crioprotetoras (DMSO, EG e sacarose) com osmolaridade de 1,5; 4,5; 6,5 e 7,5. As CGPs GFP-positivas foram visualizadas em ambas as espécies no estágio de somitogênese, localizadas na região medial do embrião, as quais migraram durante o desenvolvimento inicial. Com o transplante de blastômeros obteve-se uma quimera germinativa, a qual apresentou células fluorescentes na região das cristas gonadais, sendo observadas, inicialmente em estágio de final segmentação. Estes resultados proporcionam conhecimentos para a manipulação de embriões sob diferentes temperaturas, o que permite acelerar ou retardar estágios específicos do desenvolvimento embrionário otimizando o tempo de micromanipulação de embriões para aplicações em estudos biotecnológicos; fornece informações sobre as condições necessárias para o preparo e a manutenção de embriões e blastômeros para o transplante de células embrionárias e ainda, proporciona conhecimento sobre a morfologia e a rota de migração de CGPs endógenas de A. altiparanae e B. amazonicus o que possibilitou a produção de quimeras interespecíficas.

Primordial germ cell (PGCs) transplantation is a promising approach for aquaculture area, but it is necessary the understanding of the embryonic and larval development stages as well as the standardization of techniques related to embryo micromanipulation and germ cells in order to get germ chimeras successfully. Thus, the aims of this research were to evaluate the effect of three temperatures (22°C, 26°C and 30°C) on the early development of Brycon amazonicus (donor species); develop protocols for micromanipulation of egg, embryonic cells and blastomeres cryopreservation in Astyanax altiparanae (host species); identify the PGCs and their migration route in both species, also producing germ chimeras through transplantation of embryonic cells to host sterile species (3n) in order to produce gametes from the donor species. For this, broodstock of the involved species were hormonally induced to reproduction, and the gametes were stripped and fertilized by dry method. To evaluate the early development, newly fertilized eggs were distributed into aquarium with controlled oxygenation and temperature, collected at pre-established times and analyzed under a stereomicroscope. For the development of micromanipulation protocol of eggs from Astyanax altiparanae, it was initially evaluated the effectiveness of removing the chorion, in aliquots of newly fertilized eggs distributed on Petri dishes containing pronase (0.05%) or trypsin (0.15%) diluted in saline solutions (Holtfreter; Characin; Ringer; Hanks, D-PBS or MEM) and it was observed the most efficient enzymatic solution without affecting the viability of the embryo. After dechorionation, the eggs were submerged the same saline solutions tested for removing the chorion, free of enzymes. To determine the best incubation saline solution, morphology and quantification of the eggs were performed. Dechorionated eggs of A. altiparanae were microinjected with fluorescein isothiocyanate (FITC, green color) during the first cleavages and in blastula stage the blastomeres were dissociated and immersed in cryoprotectant solutions with different concentrations and osmolarity for vitrification. After thawing, the viability was analyzed by using propidium iodide (staining in red dead cells). For viewing and tracing of endogenous of PGCs, dechorionated eggs of A. altiparanae and B. amazonicus were microinjected with GFP-nos1 3’UTR mRNA in stage of 1-2 cells and kept in Holtfreter’s and Characin solutions, respectively, and observed at each development stage. For transplant, donor specie eggs were microinjetados with FITC in blastodisc for cell labeling, the eggs of the host species were heat shocked for triploidization (3n). When the two species reached the blastula stage, the stained blastomeres (donor) were transplanted in blastoderm of unstained host embryos. The rate of chimeric fish and the migration of the donor blastomeres the recipient embryo were measured. The results showed that the duration of the stages of development was higher at 22ºC and lower at 30°C, and the phase of 512-1000 blastomeres, the blastula stage, phase of interest to the cell transplant was 1 h 30 min at 22ºC and 25 min in the other temperatures, affecting also the time of hatching. The most efficient solution for removing the chorion in A. altiparanae was Characin solution with pronase (1:44 min) and for eggs incubation was Holtfreter's solution because of the presentation of blastomeres with similar sizes forming a uniform mass as the control. After cryopreservation, 10% of viable blastomeres were obtained in four cryoprotectant solutions (DMSO, EG and sucrose) with osmolarity of 1.5; 4.5; 6.5 and 7.5. The GFP-positive PGCs were observed in both species in the somitogenesis stage, located in the medial region of the embryo, which were migrated during the early development. With the blastomeres transplantation, it was obtained a germline chimera, showing fluorescent cells in region of gonadal ridges, being observed initially in end-stage segmentation. These results provide knowledge to manipulate embryos under different temperatures allowing to accelerate or retard specific stages of embryonic development, optimizing the time of embryo micromanipulation for applications in biotechnological studies; provide information about the conditions required for preparing and maintaining embryos and blastomeres for transplantation of embryonic cells and provide knowledge about the morphology and migration route of the endogenous PGCs of A. altiparanae and B. amazonicus, which allowed the production of interspecific chimeras.