Desenvolvimento e comparação de métodos em cromatografia líquida mono e bidimensional abrangente (LC×LC), utilizando ferramentas quimiométricas para análise de folhas de Casearia sylvestris

Abstract

Separações utilizando cromatografia líquida bidimensional têm atraído grande interesse nas últimas décadas devido ao seu elevado potencial no poder de separação para análises de misturas complexas. Apesar do uso de colunas ortogonais e da multiplicação teórica da capacidade de picos quando essa técnica é utilizada, uma questão permanece: "As técnicas bidimensionais são realmente melhores do que as monodimensionais para análises de extratos vegetais?". Esta questão motivou o presente trabalho, que consistiu em comparar o desempenho entre LC e LC×LC, utilizando amostras de folhas de Casearia sylvestris, também conhecida como "guaçatonga", uma árvore amplamente utilizada na medicina popular brasileira por apresentar diversas atividades biológicas. Além disso, devido ao grande volume de resíduos gerados em LC, a substituição de solventes convencionais por etanol (EtOH), um candidato menos tóxico e biodegradável, foi implementada. A parte mais desafiadora de qualquer cromatografia multidimensional é o desenvolvimento do método cromatográfico, pelo grande número de variáveis que devem atuar de forma integrada em uma única análise. Duas estratégias de desenvolvimento foram propostas neste trabalho. A primeira foi dividida em 4 etapas, que consistiram em selecionar o par de colunas mais ortogonal dentre as combinações disponíveis; o desenvolvimento de um método para a 1D utilizando planejamento experimental; seguido do estudo das melhores condições para a 2D (2tc, tempo de modulação e tre, o tempo de reequilíbrio após cada modulação) e por último, a escolha da melhor forma de gradiente para a 2D. A segunda estratégia consistiu em primeiramente, selecionar o par de colunas mais ortogonais dentre as combinações disponíveis; depois otimizar por planejamento experimental as duas dimensões simultaneamente e finalmente a otimização da melhor forma de gradiente para a 2D. As duas estratégias se mostraram eficazes para desenvolvimento de método bidimensional abrangente, porém a segunda estratégia mostrou-se mais rápida, devido ao menor número de experimentos necessários. Porém, o uso de etanol mostrou-se inviável para as análises rápidas e com altas vazões da 2D, devido à sua elevada viscosidade e seu uso foi descontinuado. Finalmente, com o método bidimensional completamente otimizado, este foi comparado com dois métodos em 1D-LC previamente descritos na literatura para C. sylvestris e utilizando-se a métrica de capacidade de picos, um melhor desempenho na técnica de LC×LC pôde ser observado. Concluiu-se, portanto, que a performance observada em LC×LC é significantemente melhor do que foi alcançada em 1D-LC, porém seu uso dependerá do objetivo do estudo, pois essa melhoria foi alcançada em tempos de análise muito mais longos (aproximadamente 4x) e com maior geração de resíduos (aproximadamente 30x), ou de avanços tecnológicos na técnica.

Bidimensional liquid chromatographic separations have attracted intense interest over the past decade based on the potential improvements in resolving power they offer for analysis of complex samples. Despite the use of orthogonal columns and the theoretical multiplication of peak capacity from both dimensions, one question remains: “Are bidimensional techniques superior to monodimensional ones for analysis of vegetal extracts?”. This question led to the purpose of the present work, that was to compare the performance between LC and LC×LC, using leaves from Casearia sylvestris, a widely used tree in Brazilian folk medicine by its biological activities. Furthermore, due to the large volume of waste generated by LC, the replacement of conventional solvents by ethanol (EtOH), a less toxic and biodegradable alternative solvent was chosen. The most challenging issue of any multidimensional chromatography is the method development, since the large number of interacting parameters that must work together in a single run. Two strategies for method development were used in this work. The first one was divided into 4 steps: experiments were carried out to select the most orthogonal pair of columns, 1D method development using design of experiments, another design of experiments for 2D conditions was proposed (2tc, modulation time and tre, re-equilibration time after each modulation) and aware of the best conditions for both dimensions, 2D gradient types were evaluated. The second strategy consisted of selecting the most orthogonal pair of columns, optimization of both dimensions simultaneously by design of experiments and finally evaluation of 2D gradient type. Both strategies were efficient for comprehensive bidimensional method development, but the second one was found to be faster, due to the lesser number of required experiments. Nevertheless, using ethanol as mobile phase proved to be impractical for fast and high flow rates analysis of 2D due to its high viscosity and its use as mobile phase was rejected. Finally, a comparison between the fully optimized bidimensional chromatographic method and two 1D-LC methods previously described in the literature for C. sylvestris were made. Using peak capacity as a metric of comparison, a higher performance was achieved for LC×LC. This study concluded that LC×LC provides a higher performance than 1D-LC, however, its use will depend of the analysis purpose because this gain in performance was achieved with longer analysis times (approximately 4x) and greater generation of residues (approximately 30x), or technological improvements.