Regulation of reserve carbohydrates metabolism in Neurospora crassa: responses to pH, calcium and carbon source stresses and to the biological clock

Abstract

The fungus Neurospora crassa, a model organism in studies of gene expression, metabolism, photobiology and circadian rhythm, is able to respond and adapt to different environmental stresses, such as heat shock, pH changes, nutrient limitation, osmotic stress, and others. Besides that, N. crassa has the genome sequenced and collections of knocked-out strains are avalaible to the scientific community. A systematic screening analysis performed with mutant strains in genes encoding transcription factors led to identify proteins involved in the glycogen metabolism regulation in this fungus. Glycogen and trehalose are storage carbohydrates that functions as a carbon and energy reserve. Trehalose can also protect membranes and proteins, increasing the tolerance to adverse conditions. In this work, some transcription factors were functionally characterized regarding their role in glycogen and trehalose metabolism regulation. The first condition investigated was the influence of the circadian clock in the glycogen metabolism. We observed that the glycogen accumulation and the expression of genes encoding glycogen synthase (gsn) and glycogen phosphorylase (gpn) are rhythmic in a wild-type strain and dependent on the FREQUENCY (FRQ) oscillator, the core component of the N. crassa circadian clock. The VOS-1 transcription factor, that is controlled by clock and can act in the connection between clock and glycogen metabolism, binds to gsn and gpn promoters rhythmically. However, the expression of gsn and gpn and the glycogen accumulation are still rhythmic in vos-1 strain, suggesting that not only VOS-1 but additional transcription factors could contribute to glycogen accumulation rhythmicity. Under pH and calcium stress, the PAC-3 transcription factor was investigated. First, we characterized the protein components of the pH signaling pathway, using the pal and pac-3 mutant strains. The mutants present high melanin production and inability to grow under alkaline pH. PAC-3 undergoes only one proteolytic cleavage, binds to pal promoters and regulates the expression of some pal genes under alkaline pH. PAC-3 is predominantly nuclear under alkaline condition and is able to bind to importin-α in vitro. Moreover, the components of pH signaling showed high glycogen and trehalose accumulation under normal and alkaline pH when compared to the wild-type. PAC-3 binds to some glycogenic and trehalose genes, and regulates their expression. Under calcium stress, pac-3 was induced and the carbohydrates metabolism was differently regulated. Finally, the CRE-1 transcription factor and the RCO-1 and RCM-1 cofactors, orthologs of the Mig1-Tup1-Ssn6 yeast complex, respectively, were investigated regarding their regulation of the glycogen metabolism under different carbon sources. CRE-1 is involved in catabolic repression and plays a role as repressor in glycogen regulation. CRE-1 binds in vivo and in vitro to gsn and gpn promoters, regulating their expression. This transcription factor is present in nucleus and cytoplasm in derepressed and starved conditions. RCO-1 and RCM-1 also regulated the glycogen accumulation, the glycogen synthase activity and the expression of some glycogenic genes, but do not play a major role in glycogen metabolism, while CRE-1 is the central regulator.

O fungo Neurospora crassa, um organismo modelo em estudos de expressão gênica, metabolismo, fotobiologia e ritmo circadiano, é capaz de responder e se adaptar a diferentes condições de estresse, tais como choque térmico, alterações de pH, limitação de nutrientes, estresse osmótico, entre outras. Além disso, N. crassa tem seu genoma sequenciado e coleções de linhagens mutantes estão disponíveis para a comunidade científica. Uma análise sistemática utilizando linhagens mutantes em genes que codificam fatores de transcrição permitiu a identificação de proteínas envolvidas na regulação do metabolismo do glicogênio neste fungo. Glicogênio, juntamente com trealose, são carboidratos de reserva que funcionam como fonte de carbono e energia. A trealose também pode proteger membranas e proteínas, aumentando a tolerância a condições adversas. Neste trabalho, alguns fatores de transcrição foram funcionalmente caracterizados em relação as suas participações na regulação do metabolismo de glicogênio e trealose. A primeira condição investigada foi a influência do relógio circadiano sob o metabolismo de glicogênio. Observamos que o acúmulo de glicogênio e a expressão dos genes codificadores das enzimas glicogênio sintase (gsn) e glicogênio fosforilase (gpn) foram rítmicos em uma linhagem selvagem do fungo, e dependentes do oscilador FREQUENCY (FRQ), principal componente do relógio de N. crassa. O fator de transcrição VOS-1, o qual é controlado pelo relógio e pode atuar na conexão do relógio ao metabolismo de glicogênio, se liga aos promotores gsn e gpn ritmicamente. Entretanto a expressão dos genes gsn e gpn e o acúmulo de glicogênio se mantiveram rítmicos na linhagem vos-1, sugerindo que além de VOS-1 outros fatores de transcrição poderiam contribuir para a ritmicidade do acúmulo de glicogênio. Sob condições de estresse de pH e cálcio, o fator de transcrição PAC-3 foi investigado. Primeiro, foram caracterizadas as proteínas envolvidas na via de sinalização de pH, usando as linhagens mutantes nos genes pal e pac-3. Os mutantes apresentam alta produção de melanina e incapacidade de crescer em pH alcalino. PAC-3 sofre uma única clivagem proteolítica, se liga aos promotores dos genes pal e regula a expressão de alguns destes genes em meio alcalino. PAC-3 é predominantemente nuclear sob condições alcalinas e é capaz de se ligar à importina-α in vitro. Além disso, os componentes de sinalização de pH mostraram acumular mais glicogênio e trealose sob pH normal e alcalino quando comparado à linhagem selvagem. PAC-3 se liga a alguns genes do metabolismo de glicogênio e trealose, regulando-os. Sob estresse de cálcio, a expressão de pac-3 foi induzida e o metabolismo de carboidratos diferentemente regulado. Finalmente, o fator de transcrição CRE-1 e os cofatores RCO-1 e RCM-1, ortólogos ao complexo Mig1-Tup1-Ssn6 de levedura, respectivamente, foram investigados na regulação do glicogênio sob diferentes fontes de carbono. CRE-1 está envolvido na repressão catabólica e atua como repressor na regulação do glicogênio. CRE-1 se liga in vivo e in vitro aos promotors gsn e gpn, regulando suas expressões. Este fator de transcrição está presente no núcleo e no citoplasma em condições de derepressão e baixa fonte de carbono. RCO-1 e RCM-1 também regulam o acúmulo de glicogênio, a atividade glicogênio sintase e alguns genes do glicogênio, mas não desempenham um papel primordial, enquanto CRE-1 mostrou ser um regulador central.