Obtenção e caracterização de anticorpo monoclonal murino anti-fator VIII da coagulação sangüínea

Abstract

Entre os avanços da engenharia celular e biotecnologia nas últimas décadas, destaca-se a produção de anticorpos monoclonais murinos (AcMm) utilizados no aprimoramento diagnóstico nas rotinas laboratoriais. A produção de fator VIII de alta pureza sempre foi o desejo e a preocupação das indústrias de hemoderivados para tratamento de pacientes portadores de hemofilia A, porém este produto inexiste no Brasil, sendo necessária sua obtenção no mercado internacional a custos elevados. O trabalho tem por objetivo a produção de AcMm anti-fator VIII humano (FVIII H) através da expansão dos clones e caracterização imunoquímica do anticorpo. Camundongos Balb/c foram imunizados com FVIII H purificado como também proveniente de crioprecipitado e as células esplênicas dos animais foram fusionadas com células mielomatosas murinas segundo o método descrito por Kohler e Milstein para produção de híbridos em cultura. Foram testados 1.983 híbridos dos quais 105 foram submetidos à clonagem. Destes, 39 obtiveram monoclonalidade e 7 destes clones foram caracterizados através de técnicas de immunoblotting. Foram submetidas à purificação por cromatografia três imunoglobulinas de diferentes classes pertencentes aos clones LAMB1-10A1A4, LAMB1-17A1A1 e LAMB1-24A2A1. A imunoglobulina purificada pertencente ao clone LAMB1-10A1A4 foi adsorvida em coluna de imunoafinidade para purificação de concentrado de FVIII proveniente de crioprecipitado plasmático.

Among the advances in cellular engineering and biotechnology over the last decades, the production of murine monoclonal antibodies (AcMm), used to improve laboratory diagnoses, stands out. The production of very pure factor VIII has always been a concern of suppliers of blood products to treat patients with hemophilia A and this product is still not produced in Brazil. Hence, it can only be attained on the international market at a high cost. The aim of this work was to produce AcMm anti-factor VIII human (FVIIIh) by expanding clones and characterizing the antibodies by immunochemistry. Balb/c mice were immunized with FVIII both purified and from cryoprecipitation and the splenic cells of the animals were fused with myelomatous murine cells according to the method described by Kohler and Milstein to produce hybrids in a culture. A total of 1983 hybrids were tested and 105 were selected for cloning. of these, 39 developed monoclonality and 7 of these clones were characterized through immunoblotting techniques. Three immunoglobulins from different classes, LAMB1-10A1A4, LAMB1-17A1A1 and LAMB1-24A2A1, were submitted to chromatography for purification. The purified immunoglobulin from the LAMB1-10A1A4 clone was adsorbed in the immunoaffinity column to purify the factor VIII concentrate coming from the plasmatic cryoprecipitate.