Localização sub-celular de proteínas marcadas com GFP em Xanthomonas axonopodis pv. citri por microscopia de fluorescência

Abstract

O cancro cítrico é uma doença causada pela bactéria Xanthomonas axonopodis pv. citri (Xac), e que afeta plantas de citros por todo o mundo. O genoma de Xac foi completamente seqüenciado, o que revelou grandes quantidades de ORFs (~30%) codificando para produtos com função desconhecida (proteínas hipotéticas). Baseando-se no princípio de que muitos eventos bioquímicos acontecem em sítios específicos no interior celular, a localização de proteínas em fusão com GFP tem sido amplamente utilizada para a obtenção de informações valiosas a respeito de suas funções. Para iniciarmos estudos de localização de proteínas hipotéticas em Xac, construímos um vetor integrativo capaz de expressá-las em fusão com o polipeptídio GFP, pPM2a. O vetor de expressão para Xac carrega um cassete promotor/repressor de xilose (xylR/pxyl), o gene gfp, um RBS sintético e um fragmento do gene de α-amilase de Xac, para direcionar a integração do sistema de expressão no lócus amy do cromossomo bacteriano. Mostramos aqui a integração estável do vetor no lócus amy de Xac. Além disso, mutantes de Xac expressando o polipeptídio GFP não apresentam nenhuma alteração em seu fenótipo de patogenicidade para o hospedeiro (laranja doce). Mutantes de Xac expressando versões marcadas com GFP para as proteínas ParB e ZapA, ambas codificadas por Xac, foram utilizadas para a padronização dos estudos de localização subcelular. GFP-ZapAXac apresentou um padrão de localização análogo ao de seu ortólogo presente em Bacillus subtilis: uma estrutura semelhante a uma barra, posicionada no meio do bacilo, onde o septo se desenvolve, orientado perpendicularmente com relação ao eixo longitudinal da célula. Este é o primeiro relato de um estudo de localização realizado em Xac. Ao contrário de GFP-ZapAXac, ParBXac-GFP não mostrou nenhum padrão de localização, apesar de a fusão...

Citrus canker is a disease caused by the bacterium Xanthomonas axonopodis pv. citri (Xac), which affects citrus plants worldwide. The genome of Xac was completely sequenced, which unveiled an expressive amount of ORFs (~30%) coding for products of unknown function (hypothetical proteins). Based on the principle that many biochemical events happen at specific sites within the cells, protein localization studies have been extensively used to gather valuable information about function. In order to start subcellular localization studies of hypothetical proteins encoded by Xac using fluorescent microscopy, we constructed an integrative expression vector for GFP-tagging of proteins in this bacterium, pPM2a. The expression vector for Xac carries a xylose repressor/promoter cassette (xylR/pxyl), the gfp gene, a synthetic Ribosome Binding Site (RBS), and a fragment of the α-amylase gene of Xac, to drive the integration of the whole expression system into the amy locus of the bacterial chromosome. We show here stable integration of the expression vector into the amy locus of Xac. Furthermore, Xac mutants expressing the polypeptide GFP do not exhibit any alteration in pathogenicity to the host plant sweet orange. Mutants of Xac expressing GFPtagged versions of ParB and ZapA proteins, both encoded by Xac, were used to standardize the subcellular localization studies. GFP-ZapAXac showed a localization pattern analogous to its ortholog encoded by Bacillus subtilis: a bar-like structure positioned in the middle of the rods, where the septum develops, oriented perpendicularly to the longitudinal axis of the cell. This is the first report of a protein localization study performed in Xac Unlike GFP-ZapAXac, ParBXac-GFP did not display any detectable localization pattern, despite the fact that we were able to detect the production of the fusion ParBXac-GFP in Western blot experiments... (Complete abstract click electronic access below)