Purificação e caracterização bioquímica de tanases produzidas pelo fungo filamentoso Aspergillus phoenicis

Abstract

A tanase (EC 3.1.1.20) é uma enzima capaz de hidrolisar ligações éster e depsídicas de taninos hidrolisáveis obtendo-se como produtos a glicose e o ácido elágico ou ácido gálico, sendo este último, um importante substrato para as indústrias farmacêutica e química. Entre os diferentes organismos capazes de produzir tanases, os microrganismos, de modo especial os fungos filamentosos, vêm se destacando uma vez que são mais versáteis na degradação de diferentes tipos de taninos. Neste contexto, o objetivo geral deste trabalho foi estudar a produção de tanases intra e extracelulares por Aspergillus phoenicis em Fermentação Submersa (FSbm) e em Fermentação em Substrato Sólido (FSS), melhorando as condições de cultivo para obtenção destas enzimas em altos níveis, purificando e caracterizando-as bioquimicamente. Os maiores níveis enzimáticos em FSS foram obtidos utilizando-se folhas de caju e chá verde como fonte de carbono umedecidas com solução de sais Khanna (1:1, m/v), a 30ºC por 6 dias e em FSbm tendo 2% de ácido tânico como fonte de carbono, por 3 dias a 30ºC para ambas as formas enzimáticas. Fontes de nitrogênio e fosfato aumentaram a produção de tanases quando adicionadas em baixas concentrações. As tanases extra e intracelular produzidas em FSbm foram purificadas 22 e 17 vezes com recuperação de 9% e 16%, respectivamente, após dois passos cromatográficos, DEAE-Celulose e Sepharose CL6B. A forma extracelular possui massa molar nativa de aproximadamente 218,8 kDa com 65,1% de carboidratos. Já a enzima intracelular apresentou massa molar nativa de 154,9 kDa e 43,2% de carboidratos. A temperatura ótima de atividade para ambas as enzimas purificadas foi de 60ºC e o pH ótimo de atividade ficou estabelecido na faixa de 5,0 a 6,0 para ambas as formas tanásicas. As tanases se mostraram...

(EC 3.1.1.20) is an enzyme able to hydrolize ester and depside bonds of hydrolysable tannins obtaining as products glucose and ellagic acid or gallic acid. This last one is an important substrate for the pharmaceutical and chemical industries. Among different organisms able to produce tannases, the microorganisms, especially filamentous fungi, have been highlighted since they are more versatile in the degradation of different types of tannins. In this context, the aim of this work was to study the production of intracellular and extracellular tannase from Aspergillus phoenicis under Submerged Fermentation (SbmF) and Solid Substrate Fermentation (SSF), improving culture conditions to obtain these enzymes at high levels, purifying and characterizing them biochemically. The highest enzyme levels were obtained in SSF using cashew and green tea leaves wetted with Khanna salt solution (1:1, w/v) as carbon source at 30°C for 6 days and SbmF with 2% tannic acid as carbon source, for 3 days at 30°C, for both enzymatic forms. Nitrogen and phosphate sources increased the production of tannase when added at low concentrations. The extra and intracellular tannase produced in SbmF were purified 22 and 17 times with recovery of 9% and 16%, respectively, after two chromatographic steps, DEAE-Cellulose and Sepharose CL6B. The extracellular form has native molecular mass of 218.8 kDa with 65.1% of carbohydrate content. The intracellular enzyme showed native molecular mass of 154.9 kDa and 43.2% of carbohydrate content. The optimum temperature for both purified enzymes was 60°C, and the optimum pH activity was established at a range from 5.0 to 6.0 for both enzymatic forms. Tannase proved to be quite stable at both temperature and pH and the activities remained constant for all ions tested, except for... (Complete abstract click electronic access below)