Análise bioquímica dos produtos de excreção/secreção de larvas de Dermatobia hominis

Abstract

O presente trabalho foi desenvolvido com o objetivo de caracterizar os produtos de excreção/secreção (PE/S) de larvas de Dermatobia hominis, especialmente, no que se refere à atividade proteolítica desses produtos. Os PE/S foram obtidos de larvas de primeiro estágio (L1) cultivadas em laboratório e de larvas de segundo (L2) e terceiro (L3) estágios colhidas de bovinos parasitados. O perfil das proteínas foi obtido pela eletroforese dos PE/S em gel de poliacrilamida contendo sódio dodecil sulfato (SDS-PAGE) e a atividade proteolítica foi investigada utilizando gelatina, azocaseína e N-a-benzoil-arginina-nitroanilida (BAPNA) como substratos. Para caracterização das proteases foram realizados ensaios utilizando estes mesmos substratos, nos quais as amostras foram tratadas com os inibidores: PMSF, TPCK, TLCK, DCI, E-64, EDTA, Elastatinal, Leupeptina, Fenantrolina e Antipaína. Nos PE/S de L1 foram detectadas exclusivamente proteases com peso molecular aparente acima de 168 kDa, cuja inibição revelou pertencerem aos grupos das metalo-proteases e serina-proteases. Os zimogramas dos PE/S de L2 e L3 em géis copolimerizados com gelatina revelaram uma ampla faixa de atividade proteolítica, na qual estavam presentes proteases de alto, médio e baixo pesos moleculares aparentes. Nos ensaios realizados com inibidores de proteases, utilizando os três substratos, as proteases presentes em L2 e L3 foram identificadas como pertencentes ao grupo das serina-proteases, sendo em L3, predominantemente, do tipo tripsina. As alterações nos padrões de proteólise e nas características bioquímicas das proteases presentes nos três estágios larvais discuti- se à atividade das larvas em cada fase do seu desenvolvimento.

In the present investigation the biochemical characteristics of the Dermatobia hominis larvae secretory/excretory products (PE/S) were analyzed mainly regard to their proteolytic activities. The PE/S of first-instar larvae were collected from larvae reared in the laboratory and of the second and third instars from larvae removed from infested cattle.The PE/S were tested in a sodium dodecyl sulphate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) to identify their proteic profiles and the proteases activity were investigated using gelatine, azocasein, and N-a-benzoil-arginine-nitroanilide (BAPNA) as substrates. The proteases characterizations were performed by treating PE/S samples by the following proteases inhibitors: PMSF, TPCK, DCI, E-64, EDTA, Elastatinal, Leupeptine, Phenatroline, and Antipain. SDS-PAGE-Gelatin profiles of L1 PE/S revealed only proteases with molecular weight above 168 KDa whereas profiles from L2 and L3 PE/S revealed a high range of proteolytic activity, including high, medium and low molecular weight proteases. The assays performed with the protease inhibitors, and gelatin and azocasein as substrates, revealed that metalloprotease is the major class of proteases present in the PE/S of L1 besides the low content of serine-proteases. The major class of proteases present in the PE/S of L2 and L3 was characterized as serine-proteases, being in L3 predominantly of trypsin type. The changes in the proteolytic patterns and biochemical characteristics of the proteases found in all three instar larvae of D. hominis were with the larval activity in each phase of their development.