Indução da expressão e caracterização de uma fosfatase ácida ligada à membrana produzida por Burkholderia sp

Abstract

Espécies de Burkholderia filogenéticamente distantes do complexo B. cepacia, são versáteis solubilizadores de minerais insolúveis, através da produção de ácidos, viabilizando nutrientes para as plantas. Descrevemos a purificação e caracterização da fosfatase ácida ligada à membrana, produzida pela bactéria do gênero Burkholderia, isolada de solo agrícola em Ponta grossa-PR-BRASIL, e identificada através da análise do 16s rDNA. A expressão da enzima se mostrou estritamente dependente ao fósforo (expressão ótima a 5 mM). A enzima ligada à membrana foi purificada por ultracentrifugação a 100.000g por 1 hora a 4°C e testada com atividade enzimática para p-nitrofenilfosfato (PNFF) e Pirofosfato. O pH ótimo da enzima foi 6 e não foi afetado pela concentração de PNFF. Em pH 6 a hidrolise do PNFF seguiu os seguintes parâmetros cinéticos com n=1.5, Vm= 103.8 U.mg-1 e K0,5=0,06 mM em uma faixa de 0,003 e 10 mM de PNFF. Estudos do pH sobre os parâmetros cinéticos demonstraram 26 pontos de variação na faixa de 3,5 a 6 e em seguida diminui até pH 8 enquanto K0,5 não mostrou variação nesta faixa. O H para hidrólise do PNFF foi de 5,74 kcal.mol-1. A atividade PNFFase foi inibida pelo arsenato e Cálcio, mas não por levamisol, EDTA, zinco e cobalto. A hidrolise do pirofosfato na presença de 2 mM de MgCl2 seguiu os parâmetros cinéticos de Michaelis-Menten” com Km= 0.142 mM e Vm= 237 U.mg-1.Os resultados sugerem que a produção da fosfatase ácida ligada à membrana pode ser um mecanismo de solubilização de fosfato mineral por essa bactéria.

Burkholderia species phylogenetically greatly distant from the B. cepacia complex species are versatile organisms that solubilize insoluble minerals through the production of acids, increasing the availability of nutrients to plants. Here we describe the purification and characterization a membrane-bound acid phosphatase produced by bulkholderia isolated from an agricultural soil in Ponta grossa-PR-BRASIL and identified through analysis of the 16S rDNA gene. The expression of this enzyme was demonstrated to be strictly regulated by phosphorus (optimal expression at 5 mM). The membrane bound enzyme was purified by centrifugation at 100.000g for 1 h at 4ºC and the enzyme was assayed for p-Nitrophenyl phosphatase (PNPPase) and pyrophosphatase activities. The optimal pH (6.0) was not affect by p-Nitrophenyl phosphate concentration. At pH 6.0 the hydrolysis of PNPP following a cooperative kinetics with n= 1.5, Vm= 103.8 U.mg-1 and K0.5= 0.60 mM in the range between 0.003 and 10 mM. Studies of pH effects on kinetics parameters revealed a 26-folds variation in the range of pH 3.5 to 6 following decreases until pH 8.0, wile K0,5 and cooperativity did not varied considerably in this range. The H for hydrolysis of PNPP was 5,74 kcal.mol-1. PNPPase activity was inhibited by arsenate, phosphate and calcium, but not for levamisole, EDTA, zinc, magnesium and cobalt. The hydrolysis of pyrophosphate in presence of 2 mM MgCl2 follows Michaelis-Menten” kinetics with Km= 0.142 mM and Vm= 237 U.mg-1. Our results suggesting that the production of membranebound acid phosphatase might be one mechanism of mineral phosphate solubilization by this genus of Bacterium.