Imunocaptura do vírus de Influenza aviária para dia diagnóstico em RT-PCR em tempo real

Abstract

A técnica de imunocaptura associada com a reação de transcrição reversa e reação em cadeia da polimerase (IC-RT-PCR) executadas tanto pelos procedimentos convencional como em tempo real foram testadas para a detecção rápida do gene da glicoproteína de Matriz (M) do vírus de influenza aviária (AIV) em amostras de líquido cório-alantóide (LCA) e em suabes traqueais e cloacais. O presente trabalho teve como objetivo desenvolver e otimizar a técnica de IC-RT-PCR para o diagnóstico do vírus da Influenza aviária. Os resultados obtidos foram comparados com um sistema empregando “beads” magnéticas em microplacas (AMBION), que é o método padrão de extração de RNA usado no laboratório de referência para diagnóstico de influenza aviária, o National Veterinary Services Laboratory – Ames, EUA (USDA), acrescido ainda de outros métodos de extração tradicionalmente usados nos laboratórios de referência para AIV, como os procedimentos com o uso do solvente orgânico Trizol® (Invitrogen) e com um sistema robotizado e que utiliza “beads” magnéticas (MagNA Pure - ROCHE). A técnica de IC-RT-PCR em tempo real neste estudo detectou a estirpe H2N2 do AIV, sem que nenhum outro dos RNA-vírus heterólogos testados fossem detectados (vírus das doença de Gumboro, de Newcastle e da bronquite infecciosa aviária). Os limites de detecção do IC-RTPCR foram iguais aos obtidos na técnica de extração com o kit da AMBION e menores do que aqueles que foram observados para os métodos de extração com Trizol® (Invitrogen) e com o MagNA Pure. O IC-RT-PCR demonstrou ser um sistema de diagnóstico capaz de conciliar simplicidade operacional e um menor custo com sensibilidade e especificidade analíticas iguais às do procedimento padrão atualmente adotado, podendo ser inclusive por laboratórios dotados de uma infra-estrutura mais simples

The polymerase chain reaction (PCR) and reverse transcription-PCR (RT-PCR), including real-time RT-PCR have been used for the rapid detection of Matrix glycoprotein gene (M gene) Avian influenza virus (AIV). Despite the availability of various RNA extraction methods for using in RT-PCR, isolation and detection of viral RNA are still difficult due to the unstable nature of viral RNA molecules and the presence of PCR inhibitory substances. In this study, a simple method using immune-capture (IC) to recover viral RNA from H2 AIV samples was developed and compared to one standard and two others reference methods used for viral RNA extraction, such as Ambion MagMAXTM kit and Trizol® (Invitrogen) and Magnapure kit (Roche), respectively, with subsequent analysis by real-time RT-PCR. The real-time IC-RT-PCR developed in was able to detect specifically H2N2 AIV strain, without detecting non-related avian RNA-virus pathogens, such as Newcastle disease virus, avian infectious bronchitis virus and Gumboro disease virus. Comparable detection limits were found for IC and the standard RNA extraction method using Ambion MagMAXTM kit, either for the detection of AIV in allantoic fluid suspension or in seeded tracheal and cloacal swab samples by conventional or real time RT-PCR techniques. These methods were less sensitive than Trizol® (Invitrogen) and Magnapure kit (Roche) procedures. Thus, IC was rapid and as sensitive and specific as current standard AIV RNA extraction method for real time or conventional RT-PCR, besides it conciliated simplicity and lower cost and can be applied simultaneously for direct detection of AIV in a large number of samples, including less-equipped laboratories