Estudos da enantio- e estéreo-especificidade da SADH de Thermoanaerobacter ethanolicus 39E: mutagênese, expressão, purificação, cristalização e estudos cristalográficos

Abstract

A cristalografia tem tido um papel significativo no melhoramento do nosso entendimento no modo de ação das molécular biológicas, resultando em abrangentes aplicações indústriais desta técnica. Dentro das grandes linhas de estudos envolvendo a enzima Álcool Desidrogenase Secindária (SADH) de bactérias termofílicas, essa pesquisa procurou entender as bases estruturais que controlam e regulam (i) a especificidade dela por seu substrato. Com o objetivo de aperfeiçoar suas atuais aplicações como um catalisador nas fermentações alcoólicas industriais e como catalisador em sínteses assimétricas nas indústrias faramcêuticas. Poderosas técnicas de mutagênese combinadas com cristalografia foram utilizadas. Mutações de resíduos (Gly 198 r Tyr218) que interagem com o cofator e são considerados importantes para a determinação da sua especificidade, foram planejados e executados com o objetivo de permitir o uso de um cofator alternativo que é viável para uso em escala industrial. Análises cinéticas do mutante Gly198 indicam que este é um potencial candidato e é um passo na direção certa. Mutações em aminoácidos que formam o sítio ativo foram conduzidos em um pesquisa para uma mutação com uma grande habilidade em reduzir cetonas, produzindo uma grande variedade de (R)-álcoois. Onze mutantes foram desenvolvidos e que podem exibir essas característica desejadas. Três destas enzimas mutantes foram cristalizadas e duas delas na presença de NADP e suas estruturas foram determinadas e refinadas com o objetivo de entender as bases estruturais da sua enantioseletividade para posterior desenvolvimento de uma enzima mais eficiente na utlização de cofator e produção de substratos específicos

Crystallography has played role in significantly improving our understanding of the mode of action of biological molecules resulting in wide industrial applications of thies technique.Within the framework of research dealing with Secondary Alcohol Dehydrogenases (SADHs) isolated from thermophilic bacteria, this project aims at understanding the strucutral basis which control and regulate (i) the specificity of this enzyme for the cafactor and (ii) its stereo and enantio selectivity for its substrate. With the aim of widening its realm of application as a catalyst in industrial fermentation of alcohols and as calyst in the asymmetric synthesis as applied pharmaceutically. The powerful techniques of mutagenesis combined with crystallography were utilized. Mutations of residues (Gly198 and Tyr218) wich interact with the cofactor and are considered important for determinimg its specificity were planned and executed in an attempt to permit the use of an alternative cofactor which is viable for use in an industrial scale. Kinetic analysis of the mutant (Gly198) indicates that this is a potential candiadate and is a step in the right direction. mutations of amino acids that form the active site were conducted in a search for a mutant with a greater ability to reduce ketones, producing a wide variety of r-alcohols