Caracterização molecular de proteínas que compõem o complexo spliceosomal em tripanosomatídeos

Abstract

Em tripanosomatideos, o processo de trans-splicing é responsável pelo processamento dos pré-mRNAs policistrônicos, resultando na individualização de cada gene, de modo que cada mRNA contenha a seqüência spliced leader (SL) na extremidade 5´. Esse processo requer a participação das ribonucleoproteínas (snRNPs) U2, U4/U6, U5 e SL RNP, que são constituídas por snRNAs, sete proteínas Sm (comuns a todos) e proteínas específicas de cada partícula. Neste trabalho, a proteína SmD1-PTP tagged foi produzida in vivo em formas procíclicas de Trypanosoma brucei, purificada e as proteínas ligadas a ela foram analisadas por espectrometria de massas (LC/MS/MS), tendo sido identificadas 41 proteínas que interagem com essa partícula, das quais 16 foram anotadas como proteínas conservadas hipotéticas. Dez proteínas conservadas hipotéticas foram PTPtagged para a análise de ligação aos snRNAs (U1, U2, U4, U5, U6 e SL), utilizando a reação de primer extension, após a purificação com beads de IgG e extração do RNA. Dentre as proteínas estudadas, identificou-se um homólogo de proteína específica U1-A, uma proteína Lsm, duas proteínas U5 específicas, uma proteína U4/U6 específica e três proteínas que não se ligam diretamente a esses snRNAs, mas que provavelmente participam do mecanismo como fatores de splicing.

In trypanosomatids, the trans-splicing reaction is responsible for the polycistronic pre-mRNA processing to generate individual genes which contain the 5´ end spliced leader (SL) sequence. The ribonucleoproteins (snRNPs) U2, U4/U6, U5 and SL RNP, which consist of snRNAs, seven Sm proteins (common for all) and specific proteins for each particle, participate in the process. In this work, the protein SmD1-PTP tagged was produced in vivo in procyclic forms of Trypanosoma brucei, it was purified and the binding proteins were identified by mass spectrometry (LC/MS/MS). It was possible the identification of 41 proteins that interact with this particle. Among them, 16 proteins were annotated as conserved hypothetical proteins. Ten conserved hypothetical proteins were PTPtagged for the snRNAs (U1, U2, U4, U5, U6 e SL) binding analysis using the primer extension reaction, after the IgG purification and RNA extraction. Among the proteins analysed, it was possible the identification of a homolog of the specific protein U1-A, one LSm protein, two U5 specific proteins, one U4/U6 specific protein and three proteins that did not present direct binding with the snRNAs analyzed that do not bind any of these snRNAs directely, but probably participate in the processing as splicing factors.