'Beta'-D-frutofuranosidases de Fusarium graminearum: produção, purificação, imobilização e determinação das propriedades bioquímicas de enzimas solúveis e secas em Spray dryer

Abstract

As β-D-frutofuranosidases, também conhecidas como invertases, são hidrolases que catalisam a hidrólise da sacarose em uma mistura equimolar de β-D-glicose e β-D-frutose que recebe o nome de açúcar invertido. Estas enzimas podem ser encontradas em diversos organismos, como vegetais, animais, bactérias, leveduras e em fungos filamentosos, sendo que os últimos merecem destaque pela alta produção enzimática e estabilidade. O objetivo deste trabalho foi estudar a β-D-frutofuranosidase produzida por Fusarium graminearum em Fermentação Submersa (FSbm) e Fermentação em Substrato Sólido (FSS) purificando-a e caracterizando-a bioquimicamente, além de submeter esta enzima a secagem em Spray dryer e imobilização em suportes de baixo custo. O fungo F. graminearum foi selecionado como bom produtor da enzima, com maiores níveis de produção encontrados quando cultivado em substrato sólido com farelo de trigo umidificado com água de torneira (1:1; m/v) por 9 dias (150 U/g substrato). A β-D-frutofuranosidase extracelular obtida foi purificada 8,41 vezes com recuperação de 14%, obtendo-se em PAGE 7% uma única banda protéica, e em SDS-PAGE 12%, 2 bandas proteicas (94 kDa e 70 kDa) supondo-se um heterodímero, uma vez que a enzima nativa, estimada pela coluna de filtração Sephacryl S200, apresentou 159 kDa. A temperatura ótima de atividade ficou na faixa de 55-60ºC e o pH ótimo 4,5. Foi totalmente estável em temperaturas entre 30oC e 50oC por 1 hora, e com atividade residual acima de 80% entre pH 3,0 e 8,0 por 30 minutos. A β-D-frutofuranosidase extracelular foi ativada pelos íons Mn2+ e K+. A enzima foi capaz de hidrolisar sacarose e rafinose, mas não a inulina, com maior afinidade para a rafinose, com Km de 21,16 mM e Vmax maior quando utilizada a sacarose como substrato...

The β-D-fructofuranosidases, also known as invertase, are hydrolases which catalyze the hydrolysis of sucrose in an equimolar mixture of β-D-glucose and β-D-fructose that is called invert sugar. These enzymes can be found in many organisms, such as plants, animals, bacteria, yeasts and filamentous fungi, and the latter must be highlighted for high enzyme production and stability. The objective of this work was to study the β-D-fructofuranosidase produced by Fusarium graminearum in Submerged Fermentation (SbmF) and Solid Substrate Fermentation (SSF) purifying and characterizing them biochemically, and submit this enzyme to drying using Spray dryer and immobilization on low cost supports. The F. graminearum was selected as a good enzyme producing strain, with higher production levels found when the fungus was grown on wheat bran as solid substrate moistened with tap water (1:1, w/v) for 9 days (150 U/g substrate). The extracellular β-D-fructofuranosidase obtained was purified 8.41-fold with recovery of 14%. A single protein band was obtained in 7% PAGE, and two protein bands (94 kDa and 70 kDa) in 12% SDS-PAGE indicating a heterodimeric structure, since the native enzyme, estimated by gel filtration using Sephacryl S200 column presented 159 kDa. The optimum temperature for activity was 55-60°C and optimum pH 4.5. It was completely stable at temperatures between 30oC and 50oC for 1 hour, and residual activity above 80% between pH 3.0 and 8.0 for 30 minutes was observed. This β-D-fructofuranosidase was activated by Mn2+ and K+. The enzyme was able to hydrolize sucrose and raffinose, but not inulin, with a higher affinity for raffinose, with a Km of 21.16 mM and Vmax was higher when sucrose was used as substrate (1639.34 U/mg protein). The crude extract containing the extracellular enzyme was... (Complete abstract click electronic access below)