Imobilização de amilase de Neurospora crassa (mutante exo-1) e produção de derivados ativos estabilizados

Abstract

Neste trabalho estudou-se a possibilidade de imobilização de uma amilase produzida por cepa de Neurospora crassa (mutante exo-1), e produção de derivados ativos e estabilizados. Foram testados diferentes suportes sólidos, incluindo-se diferentes suportes de agarose e suportes epóxidos preparados com Eupergit e Sepabeads. Além da agarose 10BCL foi utilizada a agarose 4BCL para que se verificasse possíveis dificuldades difusionais do substrato desta enzima, o amido. O acompanhamento das cinéticas de imobilização com a maltose como alternativa ao amido, também colaborou em evidenciar a dificuldade de difusão do amido através de ambos os suportes glioxil-agarose. O derivado obtido com agarose 10BCL, assim como aquele produzido com uso de suporte Eupergit foram os derivados mais estáveis, capazes de manter 100% de suas atividades após 12 horas de incubação à temperatura de 60°C, quando na forma solúvel a enzima conservou apenas 12% de sua atividade inicial. Quando incubados a 70°C destacou-se o derivado de glioxil-agarose (10BCL) como mais estável, mantendo cerca de 30% de sua atividade inicial após 4 horas de incubação. Quando testada a utilização de uma agarose comercial alternativa, sem percentual de crosslink conhecido, de menor custo, sua aplicação mostrou-se promissora e os derivados produzidos além de ativos se apresentam estáveis frente à temperatura. Em conjunto, as informações contidas no presente estudo indicam que a amilase de Neurospora crassa apresenta-se promissora em comparação às amilases de mercado aqui estudadas, tanto em sua utilização na forma solúvel quanto no que se relaciona a produção de derivados estáveis.

In this work were studied the immobilization of amylase from Neurospora crassa (Mutant Exo-1). This amylase showed easily production, purification and high capacity of immobilization on agarose and epoxy supports. It was used crosslinked agarose with two polymer concentration: 4 and 10%. The 4BCL agarose presents bigger porous diameter than 10 BCL agarose, so, in this case, possible diffusion problems of the starch across the supports could be reduced. Also, in this study, we have tested two epoxy supports for this amylase immobilization, using Eupergit and Sephabeads supports. The activies of the obtained derivatives were measured using two substrates - maltose and starch. Both glyoxyl agarose support prepared with 4BCl and 10BCL agarose present diffusion problems when the starch was used as substrate to measure the immobilization course. The 10BCL glyoxyl derivative presented the highest thermal stability when comparing the others derivatives. Among the epoxy derivatives the Eupergit one were better than the derivatives obtained using Sepabeads as support. In a confrontation between the two best derivatives, that is, the glyoxyl 10 BCL and Eupergit derivatives, both of them were stable at 60º incubation, maintaining 100% of activities for 12 hours, while the soluble amylase preserved about 12% of initial activity. These two amylase derivatives only showed differences at 70ºC incubation, when the glyoxyl 10BCL amylase derivative was more thermally stable, preserving about 30% of the initial activity after 4 hours.