Clonagem e expressão da proteína do core do vírus da hepatite C para o desenvolvimento de métodos aplicados ao diagnóstico viral

Abstract

O presente trabalho refere-se ao desenvolvimento de duas metodologias: imobilização da proteína do core do vírus da Hepatite C (VHC) em matriz híbrida siloxano-poli (propileno óxido) como suporte sólido para ELISA e um imunossensor amperométrico para detecção de anticorpos anti-VHC. Para atingir este objetivo, o RNA-VHC extraído de amostras de soro (genótipo 1b) foi submetido à técnica de RT-PCR e posterior amplificação da seqüência de 408pb do core do VHC. Este produto foi clonado em vetor pET42a. O vetor recombinante foi introduzido em bactérias da linhagem BL21 (DES). Após o cultivo das colônias, a indução foi realizada em concentração final de 0,4mM de IPTG. As bactérias foram lisadas e as frações solúvel e insolúvel, analisadas em gel de poliacrilamida 15%, mostrando uma banda aparente de 44kDa, tamanho esperado da proteína recombinante fusionada a GST. A proteína recombinante do core foi purificada e confirmada por imunodetecção utilizando soro positivo para VHC e apresentou ausência de reatividade cruzada com amostras positivas para outras doenças infecciosas. Na primeira metodologia, a proteína do core foi imobilizada em matriz híbrida siloxano-poli (propileno óxido) preparada por sol-gel como suporte sólido em teste de ELISA para a detecção de anticorpos anti-VHC. As condições adequadas para o estabelecimento desta técnica envolveram 1,25ng da proteína/disco, conjugado com peroxidase na diluição 1:10000 e diluição do soro de 1:40. Este procedimento foi comparado ao ELISA convencional. O desenvolvimento desta matriz híbrida para imunodetecção mostrou bom desempenho, reprodutibilidade e simplicidade durante a síntese, sendo vantajoso para aplicação comercial.

The present work reports the development of two methodologies: hepatitis C vírus core protein immobilization into hybrid matrix siloxane-polypropyleneglycol prepared by sol-gel process used as solid phase in ELISA and an amperometric immunosensor for detection of antibodies anti-VHC. Toward to achieve this aim, the HCV RNA from serum (genotype 1b) was submitted to RT-PCR techniqueand subsequent amplification of the HCV core 408pb. This product was cloned into pET42a vector. The recombinant plasmid was transformed into BL21 (DES) cell line strain. Cell cultures were grown and induced with final concentration of 0,4mM of IPTG. After induction, the cell were harvest and the soluble and insoluble fractions were analyzed by polyacrilamide gel 15% showing a band with an approximate molecular weight of 44kDa, expected size for this GST-fused recombinant protein. The recombinant protein was purified and confirmed by immunological detection using HCV positive serum and showed absence of cross reactivity with positive samples for others infectious diseases. In the first methodology, the core protein immobilization into hybrid matrix siloxane-polypropyleneglycol prepared by sol-gel process was used as solid phase in ELISA for detection of antibodies anti-VHC antibody. 1,25ng protein per disc, a peroxidase conjugate diluition of 1:10000 and a serum dilution of 1:40 were adequate for the establishment of the procedure. This procedure performance of the siloxane-polypropyleneglycol discs as a matrix for immnunodetection, showed easy synthesis, good performance and reproducibility for commercial application. The second consisted on the immobilization of core protein into hybrid matrix siloxane-polypropyleneglycol prepared by sol-gel process and deposited on the pencil graphite electrode surface by dip-coating process for development of an amperometric immunosensor.