Caracterização funcional dos elementos de transcrição do gene da glicogênio sintase (gsn) de Neurospora crassa

Abstract

As células eucarióticas são capazes de responder e de se adaptar a diferentes condições ambientais estressantes tais como o choque térmico, modulando sua atividade metabólica. Na levedura Saccharomyces cerevisiae o choque térmico é conhecido por induzir múltiplos genes relacionados a esta forma de estresse, através dos elementos transativadores Hsf1p (Heat Shock Protein) e Msn2/4p, os quais se ligam, respectivamente, às seqüências consensos HSE e STRE, ativando a transcrição. A seqüência nucleotídica do gene da glicogênio sintase (gsn) de Neurospora crassa foi previamente isolada em nosso laboratório e uma análise da expressão gênica mostrou que a transcrição do gene foi diminuída na situação de choque térmico (30 para 45ºC). Uma análise da região 5' flanqueadora revelou a presença dos elementos de DNA CRE, HSE e STRE tanto na região promotora do gene quanto na 5'-UTR. Neste trabalho, nós investigamos o envolvimento destes elementos de DNA na regulação da transcrição na condição de choque térmico, através de ensaios de mobilidade em gel (EMSA) usando como sondas, fragmentos de DNA contendo os elementos transcricionais citados anteriormente. Para isto, foram utilizados como fonte de proteínas extratos nucleares brutos ou fracionados em coluna de Heparina-Sepharose, preparados a partir de micélios coletados antes e após choque térmico (amostras HS30). Os resultados obtidos mostraram a presença de proteínas capazes de reconhecer e ligar aos elementos de DNA testados sob a condição estressante analisada. A especificidade das bandas de mobilidade reduzida foi confirmada por diferentes ensaios de competição, tais como 1) adição prévia de sondas de DNA não marcadas antes da reação de ligação, 2) adição de oligonucleotídeo de DNA dupla fita contendo o elemento STRE do promotor gsn como competidor específico, 3) utilização...

Eukaryotic cells respond and adapt to environmental stressing conditions such as heat shock, by modulating metabolic responses to counteract them. In the yeast Saccharomyces cerevisiae heat shock activates multiple stressing related genes by the trans acting elements Hsfp (Heat shock factors) and Msn2/4p, which bind to the cis regulatory elements HSE (Heat Shock Element) and STRE (Stress Responsive Element), respectively, and activates the gene transcription. We have previously isolated the gene encoding the Neurospora crassa glycogen synthase (gsn) and demonstrated that the gene transcription was decreased under heat shock (30 to 45ºC). An analysis of the gsn 5' flanking region showed the presence of the DNA elements CRE, HSE, and STRE, in the promoter region and in the 5'-untranslated region. In this work we investigated the involvement of these DNA elements in gene transcription regulation under heat shock condition by performing electrophoretic mobility shift assays (EMSA) using, as probes, DNA fragments containing the regulatory elements, and crude or Heparin-Sepharose fractionated nuclear extracts prepared from mycelia collected before and after 30 min of heat shock (HS30 sample). Ours results showed the presence of nuclear proteins capable to recognize and bind to the DNA regulatory elements under heat stress. The specificity of the DNA shifts were confirmed by using 1) unlabelled DNA probes as specific competitor, 2) the gsn promoter STRE double-stranded oligonucleotide as specific competitor, 3) a mutated gsn promoter STRE probe, and 4) the HSE unlabelled probe in a cross-reaction competition assay with the gsn promoter STRE probe. The involvement of the regulatory CRE elements in the modulation of the gsn gene transcription was investigated by using EMSA in the wild type strain, and also in two N. crassa mutant strains defective in the cAMP-signaling pathway: one having hyperactive...(Complete abstract click electronic access below)