Avaliação da infecção de megacariócitos e plaquetas pelo VHC e sua influência na fisiopatologia da hepatite C

Abstract

A hepatite C acomete cerca de 130-150 milhões de pessoas em todo o mundo, sendo que grande parcela dos portadores do vírus da hepatite C (VHC) permanecem assintomáticos por longos períodos. O diagnóstico da doença acontece muitas vezes devido a sintomas extra-hepáticos como fadiga crônica, alterações endócrinas, dermatológicas e hematológicas, porém, a patogênese das manifestações extra-hepática é pouco conhecida. Assim, modelos que reproduzam a infecção in vitro pelo VHC se tornam necessários para que se possa compreender e esclarecer a relação entre estas desordens e o VHC. O VHC é um Hepacivírus da família Flaviviridae, sua entrada em células suscetíveis, como os hepatócitos, pode ocorrer por infecção direta, mediada principalmente pelos receptores CD81 e Claudina-1 (CLDN1), desencadeando uma série de processo para internalização e replicação viral, ou por infecção por contato célula-a-célula, mediada por CLDN1 e Ocludina (OCLN), não sendo necessário, por esta via, CD81. Estudos evidenciam a interação entre plaquetas e VHC, no entanto, não demonstram claramente se estas células somente aderem às partículas virais ou se são infectadas pelo vírus. Assim, estudos que contribuam à elucidação deste processo são salutares. Desta forma, o objetivo deste trabalho foi avaliar a infecção de megacariócitos e plaquetas pelo VHC e verificar a influência na fisiopatologia da hepatite C. Amostras de megacariócitos, provenientes de doadores de medula óssea, e amostras de plaquetas periféricas, ambas obtidas de doadores saudáveis, foram infectadas in vitro com plasma VHC positivo. As amostras infectadas foram avaliadas por citometria de fluxo e microscopia confocal. Os parâmetros analisados foram presença ou ausência viral e a expressão dos receptores CLDN1 e CD81. Os resultados de ambas as técnicas foram complementares. Encontrou-se presença de VHC tanto na superfície como no citoplasma de plaquetas, demonstrando, de modo inédito, a presença do VHC no citoplasma nestas células. Foi também observada a expressão de CLDN1 nas plaquetas, podendo este receptor ter papel fundamental na interação entre VHC e plaquetas pela via de infecção por contato, visto que estas células não expressam CD81. Megacariócitos também apresentaram VHC na superfície e no interior celular. Eles expressam CD81 e CLDN-1, característica que os enquadram na categoria de células suscetíveis ao vírus via infecção direta. Relatos na literatura apontam que esta célula pode suportar a replicação viral, podendo ser considerada como reservatório de replicação extra-hepático. Estudos conduzidos independentemente demonstram que a infecção de VHC em plaquetas e megacariócitos está relacionada à trombocitopenia periférica. Além disso, fatores secundários como comprometimento hepático, levam ao desequilíbrio na produção de trombopoetina, principal fator na manutenção do processo de trombopoese. Nosso estudo permitiu através do estabelecimento de infecção in vitro concluir que plaquetas, além de interagirem com VHC, expressam o vírus no seu interior, tornando-se veículos e reservatórios virais. Ademais, megacariócitos se infectam com o vírus, o que pode impactar na produção de plaquetas infectadas, visto que estes são os precursores plaquetários. Esses achados, em conjunto, podem contribuir para o entendimento da trombocitopenia, manifestação extra-hepática comumente observada nos pacientes com hepatite C crônica. Palavras-chave: Infecção in vitro; Megacariócitos; Plaquetas; Vírus da hepatite C.

Hepatitis C affects about 130-150 million people worldwide. It´s caused by Hepacivirus and the diagnosis are by extrahepatic symptoms such as chronic fatigue, endocrine, dermatologic and hematologic changes. However, the pathogenesis of extrahepatic manifestations is little known and requires further studies on the relationship of these disorders and the hepatitis C vírus (HCV), therefore infection in vitro model can improve this kind of knowledge. HCV is a family of Flaviviridae, its entry into susceptible cells, such as hepatocytes, can occur by direct infection mediated primarily by CD81 receptors and Claudin-1 (CLDN1), triggering a process serie for internalization and viral replication ocurr. Other road is by cell-to-cell mediated CLDN1 and occludin (OCLN), not being necessary the presence of CD81. Studies describe the interaction between platelets and HCV, however, does not clearly denotes how this process happens, due to this, studies can contribute to the elucidation of this process relevance. The aim of this study is the evaluation of the infection of megakaryocytes and platelets HCV and the influence in pathophysiology of hepatitis C. Megakaryocytes samples, from bone marrow donors, and samples of peripheral platelets, both obtained from healthy donos are infected in vitro with HCV positive plasma. Infected samples were evaluated by flow cytometry and confocal microscopy. The parameters analyzed were the presence or absence of viral and expression of CLDN1 and CD81 receptors. The results of both techniques are complementary. It was founded the presence of HCV both in surface and in cytoplasm of platelets by flow cytometry and confocal microscopy, fact not previously reported. The receptor analysis showed the presence of CLDN1, one of the proteins involved in the viral transmission cell-cell, so the interaction can occur in this via. CD81 was absent, as reported in literature. Megakaryocytes also had HCV on the surface and inside the cells. They express CD81 and CLDN-1, so then are susceptible to viruses via direct infection. Reports in the literature suggest that this cell can support viral replication, and can be considered as extrahepatic replication reservoir. Studies conducted independently demonstrated that HCV infection in platelets and megakaryocytes is related to peripheral thrombocytopenia. In addition, secondary factors such as hepatic damage, affect the levels and production of thrombopoietin, the main factor in maintaining trombopoese process. The study found virus at surface and in the cytoplasm of platelet infected in vitro, indicating that platelet can interacting with HCV an can be a vehicles to the infection or reservoir of HCV. In addition, megakaryocytes are infected in vitro with the virus, which can produce platelets infected ou be a reservoir of HCV, since these are the platelet precursors. This findings demonstrate an infection model efficient and can contribute to the understanding of thrombocytopenia and extrahepatic manifestations, commonly observed in patients with chronic hepatitis C Keywords: In vitro infection; megakaryocytes; platelets; Hepatitis C virus.